氧氟沙星與二氟沙星的抗體制備及ELISA方法建立.pdf

1、本研究將氧氟沙星(ofloxacin,OFL)和二氟沙星(difloxacin,DIF)分別與兩種載體蛋白偶聯(lián)合成了四種人工抗原。用合成的免疫原免疫長耳白兔，制備出高效價的抗OFL血清、抗DIF血清與混免血清(抗OFL和DIF血清)。分別以抗OFL血清和混免血清為核心建立了檢測氧氟沙星的間接競爭酶聯(lián)免疫吸附測定法(Ci-ELISA法)；并分別以抗DIF血清和混免血清為核心建立了檢測二氟沙星的Ci-ELISA法。 1.二氟沙星和氧

2、氟沙星人工抗原的合成及鑒定采用碳二亞胺法，將氧氟沙星分別與載體蛋白牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)偶聯(lián)，同樣將二氟沙星分別與BSA和OVA偶聯(lián)，制備出四種人工抗原OFL-BSA、OFL-OVA、DIF-BSA和DIF-OVA。由FeCl3顯色反應(yīng)結(jié)果可知：徹底透析的人工抗原溶液與FeCl3反應(yīng)后出現(xiàn)不同程度的橙黃色且略顯渾濁，透析外液、BSA溶液和OVA溶液則呈現(xiàn)淺黃色，說明透析內(nèi)液中存在大量連接在載體蛋白上的二氟沙星或氧氟

3、沙星，由此可初步推斷二氟沙星和氧氟沙星與載體蛋白BSA和OVA的交聯(lián)成功。紫外掃描圖譜顯示人工抗原的最大吸收峰即不同于載體，也不同于半抗原，另外人工抗原的紫外掃描圖譜還顯示有半抗原的特征性吸收峰出現(xiàn)，進一步說明交聯(lián)反應(yīng)成功。用紫外光譜法計算出OFL-BSA、OFL-OVA、DIF-BSA和DIF-OVA的半抗原結(jié)合比分別是¨.16∶1、5.90∶1、5.47∶1和6.40∶1。 2.抗體制備與ELISA工作濃度的測定用人工合成的

4、免疫抗原DIF-BSA、OFL-BSA及其混合物(1∶1)分別免疫長耳白兔，制備出了三種抗血清：抗DIF血清、抗OFL血清、混免血清(抗DIF和OFL血清)?？筄FL血清和抗DIF血清的效價均為1∶29×104；混免血清用OFL-OVA包被時效價為1∶29×104，用DIF-OVA包被時效價為1∶28×104。用抗OFL血清和混免血清分別建立檢測OFL的Ci-ELISA法時，包被抗原(OFL-OVA)的工作濃度分別為2μg/ml和0.2

5、5μg/ml，抗OFL血清和混免血清的工作濃度均為1∶4×105。用抗DIF血清和混免血清分別建立檢測DIF的Ci-ELISA法時，包被抗原(DIF-OVA)的工作濃度分別為0.25μg/ml和1μg/ml，抗DIF血清和混免血清的工作濃度分別為1∶2×105和1∶4×105。 3.間接競爭酶聯(lián)免疫吸附測定法(Ci-ELISA法)的建立用抗OFL血清和混免血清分別建立了OFL的Ci-ELISA標準曲線。OFL抑制抗OFL血清的標

6、準曲線的線性回歸方程為y=-0.2044x+0.961(r=0.9927)，半數(shù)抑制量(IC50)=180.32ng/ml，最低檢測限(LOD)=0.85ng/ml，線性范圍為0.85～10000ng/ml；OFL抑制混免血清的標準曲線的線性回歸方程為y=-0.1984x+0.9687(r=0.9885)，IC50=231.57ng/ml，LOD=1.62ng/ml，線性范圍為1.62～10000ng/ml。另外還用抗DIF血清和混免血

7、清分別建立了DIF的Ci-ELISA標準曲線，DIF抑制抗DIF血清的標準曲線的線性回歸方程為y=-0.223x+0.9631(r=0.9929)，IC50=119.21ng/ml，LOD=1.14ng/ml，線性范圍為1.14～10000ng/ml；DIF抑制混免血清的標準曲線的線性回歸方程為y=-0.1738x+0.915(r=0.9985)，IC50=245.32ng/ml，LOD=1.86ng/ml，線性范圍為1.86～1000

8、0ng/ml。由以上結(jié)果可知，研究建立的標準曲線在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；建立的Ci-ELISA方法的靈敏度達到目前對OFL或DIF的檢測要求。 本研究用三種血清建立的檢測方法的批內(nèi)CV均在7％以內(nèi)，批間CV均在15％以內(nèi)，符合方法所需的精密度要求。交叉反應(yīng)性實驗結(jié)果表明：制備的抗體與選擇的氟喹諾酮類藥物都有一定的交叉反應(yīng)，與磺胺嘧啶、氯霉素、土霉素和阿莫西林無交叉反應(yīng)(交叉反應(yīng)率＜0.01％)。由牛奶中添加回收實驗的結(jié)果