軟骨藻酸的多克隆抗體制備及間接ELISA方法的建立.pdf

1、軟骨藻酸是由海洋硅藻中的擬菱形藻屬產(chǎn)生的一種海洋生物毒素,被海洋生物(如貝類(lèi)、蟹等)攝食后能夠在其體內(nèi)富集,人類(lèi)若誤食被污染的海產(chǎn)品,會(huì)造成腹瀉嘔吐、記憶喪失等癥狀,嚴(yán)重者甚至昏迷死亡,因此又被稱(chēng)作失去記憶性貝毒。軟骨藻酸曾在加拿大引發(fā)過(guò)集體中毒事件,嚴(yán)重威脅人類(lèi)身體健康。我國(guó)雖然未曾發(fā)生過(guò)此類(lèi)中毒事件,但隨著赤潮頻發(fā)、有毒赤潮爆發(fā)次數(shù)的增多及國(guó)際水產(chǎn)的交易量日趨增大,海產(chǎn)品中的毒素檢測(cè)問(wèn)題不容忽視。軟骨藻酸通常使用的檢測(cè)方法包括小白鼠

2、生物檢測(cè)法、高效液相色譜-紫外檢測(cè)法、免疫分析法等。小白鼠生物檢測(cè)法因其不能達(dá)到各國(guó)對(duì)海產(chǎn)品中軟骨藻酸含量限值(20μg/g)而逐步被各國(guó)淘汰,而高效液相色譜檢測(cè)成本過(guò)高,不適合基層單位對(duì)大批量樣品進(jìn)行檢測(cè)。免疫分析法檢測(cè)限低,能迅速檢測(cè)大量樣本,已在農(nóng)藥獸藥及醫(yī)藥上有廣泛應(yīng)用。然而我國(guó)在赤潮藻毒素免疫分析上,遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于國(guó)外,因此迫切需要在這方面建立起有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的快速免疫分析法。本文采用活潑酯法將軟骨藻酸與載體蛋白鑰孔血藍(lán)蛋白(KL

3、H)、牛血清白蛋白(BSA)進(jìn)行偶聯(lián),制備了相應(yīng)的完全免疫抗原DA-KLH及包被抗原DA-BS,用紫外掃描驗(yàn)證偶聯(lián)的成功與否。并設(shè)計(jì)了合適的免疫程序,用所合成的免疫抗原DA-KLH對(duì)新西蘭白兔進(jìn)行頸背部多點(diǎn)免疫。第三次免疫起,用間接ELISA方法測(cè)定血清中抗體含量。當(dāng)抗體效價(jià)達(dá)到一定程度后,心臟取血,分離血清,經(jīng)辛酸-硫酸銨兩步法純化后獲得多克隆抗體,并驗(yàn)證了抗體的特異性。初步建立了軟骨藻酸的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA(ic-ELISA)檢測(cè)法

4、:確定了包被抗原及抗體最佳工作濃度,最佳封閉液種類(lèi)及封閉時(shí)間,最佳一抗二抗溫育條件。最后用所建立ic-ELISA法及HPLC-UVD等兩種方法對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行了檢測(cè)與比較。具體結(jié)果與結(jié)論如下:
　　1.采用活潑酯法,將軟骨藻酸與載體蛋白鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)進(jìn)行偶聯(lián),制備了相應(yīng)的完全免疫抗原DA-KLH及包被抗原DA-BSA,并通過(guò)紫外光譜掃描定性鑒定偶聯(lián)成功。
　　2.采用頸背部多點(diǎn)免疫法,經(jīng)過(guò)9次共

5、19周的免疫獲得效價(jià)為1600的抗血清,純化后得到效價(jià)為800的抗體。抗體與L-谷氨酸及D-天門(mén)冬氨酸無(wú)交叉反應(yīng)率。
　　3.建立并優(yōu)化了軟骨藻酸的ic-ELISA檢測(cè)法:確定了包被抗原及抗體最佳工作濃度分別為6400倍和800倍,包被抗原濃度為0.99μg/mL。二抗最佳使用濃度為稀釋3000倍。最佳封閉液為1％ PVA,封閉時(shí)間為2 h。最佳一抗溫育條件和最佳二抗溫育條件是使用含4% PEG的抗體稀釋液,37℃溫育1 h。

6、r>　　4.在10 ng/mL~10μg/mL范圍內(nèi)繪制了間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA的標(biāo)線,線性回歸方程為y=109.40-15.45x,相關(guān)系數(shù)R2為0.9682,最低檢測(cè)限約為18 ng/mL。
　　5.采用HPLC-UVD法分析了市售三種貝類(lèi)樣品,均無(wú)DA檢出,定容前加標(biāo)回收率為68.0%~84.0%,勻漿前加標(biāo)率略低,表明樣品的前處理可能對(duì)低劑量加標(biāo)的回收率有影響。
　　6.采用所建立的ic-ELISA法對(duì)比分析上述三種貝類(lèi)