γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的制備、酶學(xué)性質(zhì)及其在小肽合成中應(yīng)用的研究.pdf

1、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-glutamyltranspeptidase,γ-GTP)可以催化γ-谷氨?；衔镏泄劝滨；乃獠阉D(zhuǎn)移到其他氨基酸或小肽上,具有非常廣闊的工業(yè)應(yīng)用前景.國外已經(jīng)對γ-GTP的性質(zhì)及其在小肽合成中的應(yīng)用做了深入的研究.但國內(nèi)對其研究還幾乎是空白.本論文從本實驗室保藏的γ-GTP高產(chǎn)菌-枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)NX-2出發(fā),通過對培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化,確定了適合實驗室搖瓶培養(yǎng)和發(fā)酵罐

2、培養(yǎng)的培養(yǎng)基:蔗糖2﹪,玉米漿3﹪,蛋白胨1﹪,K<,2>HPO<,4> 1.5﹪,MgSO<,4>0.05﹪;培養(yǎng)條件(搖瓶中):起始pH7.5,裝液量60mL/500mL三角瓶,培養(yǎng)溫度32℃,培養(yǎng)時間36小時.搖瓶中B.subtilis NX-2產(chǎn)γ-GTP的量由2.0U/mL提高到3.2U/mL,大于文獻(xiàn)報道的最高3.0U/mL.并研究了γ-GTP在搖瓶和發(fā)酵罐中生長的過程曲線.研究了γ-GTP在(Bacillus subtil

3、is)NX-2發(fā)酵體系中的分布:γ-GTP產(chǎn)生于B.subtilis NX-2胞周間質(zhì)處,60﹪分泌到發(fā)酵液中.建立了針對該發(fā)酵體系的γ-GTP純化方法:首先用等體積丙酮沉降,復(fù)溶后用60-90﹪硫酸銨梯度分離,然后以pH8.0,0.05mol/L Tris-HCL為緩沖液,進(jìn)行疏水層析分離,以0.3mol/L硫酸銨洗脫,最后進(jìn)行DEAE離子交換層析,以0.1mol/L-0.4mol/LNaCL(30min)梯度洗脫,收集第一個洗脫峰.

4、對純化得到的酶蛋白進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠色譜分析,該酶兩個亞基分別為43,000Da和32,000Da.γ-GTP可以耐受60℃以下的溫度,在堿性環(huán)境下比較穩(wěn)定,酸性環(huán)境下很容易失活.最適反應(yīng)溫度為40℃,最適反應(yīng)pH值為8.0.在較低溫度下表現(xiàn)出較高的接肽率,在40℃接肽活力最高,60℃時水解活力最高.γ-GTP的接肽率隨著pH的升高而升高,在pH8.0時水解活力和接肽活力均為最高.隨著時間的變化,γ-GTP的接肽率逐漸下降而水解