轉(zhuǎn)谷氨酰酶基因的克隆表達及發(fā)酵條件優(yōu)化.pdf

1、素有“超級粘合劑”之稱的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶作為一種新型的食品添加劑，大大改善了蛋白質(zhì)的功能特性，對開發(fā)新型食品和提高產(chǎn)品品質(zhì)具有積極的促進作用，應(yīng)用前景十分廣闊。但是，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶到目前為止并沒有在中國的食品工業(yè)中得到廣泛的推廣應(yīng)用，主要原因在于：1進口轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶價格昂貴，使用它將大大提高食品的生產(chǎn)成本：2國內(nèi)使用的產(chǎn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶菌株產(chǎn)酶量較低，酶活也不高，生產(chǎn)成本較為昂貴。為了獲得能夠高產(chǎn)的基因工程菌，首先需要獲得產(chǎn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的野生菌。

2、
　　 本實驗利用簡便的蛋白質(zhì)交聯(lián)凝絮-沉淀性能測定試驗進行初篩，最終獲得一株酶活達到0.47U/ml的野生菌株，經(jīng)生理生化及16SrDNA鑒定后屬于放線菌綱的鏈霉菌屬(Streptomyces sp.)。然后擴增出轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的基因，并在大腸桿菌中表達，以獲得高產(chǎn)的重組轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.產(chǎn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶菌株的篩選。采集了多份土壤，為了避免在菌種初篩過程中就直接測定MTG活性而需要大量使用價格昂貴

3、的酶作用底物CBZ-G1n-GLy，節(jié)省時間精力和經(jīng)費開支，采用蛋白質(zhì)交聯(lián)凝絮-沉淀性能測定試驗進行初篩，然后復(fù)篩時在測定酶活，篩選出活性相對較高的菌株St4，酶活達到0.47U/ml。
　　 2.菌株的鑒定。根據(jù)菌株形態(tài)、培養(yǎng)特征、生理生化特性、16S rDNA序列分析等進行多項分類鑒定研究，初步鑒定出St4為放線菌類鏈霉菌屬中的吸水鏈霉菌。
　　 3.MTG基因的擴增。設(shè)計簡并引物，首先擴增出含活性中心的中心序列，然

4、后用sitefinding-PCR分別擴增出上下游序列，完成對MTG全長基因的擴增。吸水鏈霉菌st4的MTG基因編碼區(qū)總長為1251bp，與已公布來源的吸水鏈霉菌推測的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因序列EU477523比較，有214個堿基的差異，核苷酸序列的同源性為83％，第149位氨基酸Cys為活性中心位點，成熟酶分子中催化三聯(lián)體為Cys149-His359-ASp346與其它鏈霉菌來源的同源酶一致。
　　 4.轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶表達及發(fā)酵條件優(yōu)

5、化。將MTG基因與大腸桿菌胞內(nèi)表達載體pET-23(a)和pET-32(a)連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-23(a)-MTG和pET-32(a)-MTG，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中進行表達。使用SDS-PAGE電泳、酶活測定的檢測證明MTG的正確表達，接著對重組酶的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果表明：該轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶重組菌在pH6.5的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至2.5h時，加入IPTG至終濃度為75μg/mL，30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4h酶活達到10.23U