基于信號(hào)放大核酸適配體和G-四鏈體探針的生化分析新方法.pdf

1、生物傳感器具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、選擇性好、分析速度快、檢測(cè)成本低等特點(diǎn)，在生化分析、環(huán)境監(jiān)測(cè)、臨床診斷和藥物篩選領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。同時(shí)，由于核酸具有合成容易、穩(wěn)定性好、設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、生物相容性好、信號(hào)機(jī)制靈活等諸多優(yōu)勢(shì)，它是構(gòu)建生物傳感器的重要素材。另外，它還可以借助各種信號(hào)放大方法實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物高效快速的高靈敏度檢測(cè)。本論文借助核酸適配體、分子信標(biāo)、G-四鏈體、金納米粒子和脫氧核酶的優(yōu)良的特性和全新的設(shè)計(jì)思路，依據(jù)不同的分析物的檢測(cè)

2、建立了各種高效的檢測(cè)方法。和傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比，本論文所建立的檢測(cè)方法具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、分析成本低廉的特點(diǎn)，這為生物傳感技術(shù)的快速發(fā)展提供了一定程度的借鑒意義。
　　免疫球蛋白E(IgE)的測(cè)定在過敏性鼻炎和過敏性哮喘等相關(guān)疾病的臨床診斷中具有重要作用。在第2章中，搭建了基于電子通道開關(guān)核酸適配體電化學(xué)傳感器用于IgE的檢測(cè)。在該傳感檢測(cè)中，免疫球蛋白E綁定到核酸適配體上導(dǎo)致覆蓋堿性磷酸酶(ALP)。同時(shí)，由于IgE是非傳導(dǎo)

3、性介質(zhì)，使得ALP不能催化1-萘基磷酸酯水解產(chǎn)物-萘酚生成電活性物質(zhì)。因此，IgE與核酸適配體結(jié)合阻礙電子轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致電流強(qiáng)度下降。該電化學(xué)傳感器的信號(hào)產(chǎn)生不依賴于核酸適配體探針的構(gòu)象變化，它克服傳統(tǒng)的電化學(xué)核酸適配體傳感器遇到的困難。并且該方法具有較高的靈敏度，其檢測(cè)下限達(dá)到4.44×10-6μg·mL-1(22.7fM)。在復(fù)雜環(huán)境中，該檢測(cè)方法同樣表現(xiàn)出了良好的分析性能，血清樣品中的回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果令人滿意。
　　赭曲霉素A(OT

4、A)是對(duì)人類和動(dòng)物的健康有極大危害的元素，包括腎臟損害、致畸性、致癌性、細(xì)胞毒性和遺傳毒性等。第3章中，針對(duì)核酸適配體電化學(xué)傳感器檢測(cè)小分子性能有待提高的情況，將核酸適配體序列在恰當(dāng)?shù)牟课患羟谐蓛啥?，?gòu)建電信號(hào)增強(qiáng)型核酸適配體傳感探針。該方法靈敏度較高、選擇性好、操作簡(jiǎn)單和低成本，同時(shí)為基于核酸適配體探針檢測(cè)其它生物分子提供了一條有效的途徑。
　　三磷酸腺苷(ATP)是生物體內(nèi)細(xì)胞一切生命活動(dòng)所需能量的直接來源，參與體內(nèi)脂肪、糖、

5、蛋白質(zhì)和核苷酸的合成。迅速而準(zhǔn)確地檢測(cè)ATP，對(duì)于研究生物體的新陳代謝過程和疾病的臨床診斷等方面都有非常重要的意義。第4章中，以ATP為模型分析物，將ATP核酸適配體剪切成合適的兩部分，同時(shí)結(jié)合雜交連鎖反應(yīng)(hybridization chain reaction，HCR)信號(hào)放大技術(shù)，構(gòu)建了一種基于核酸適配體-HCR的電化學(xué)傳感器用于ATP的檢測(cè)。兩條剪切的核酸適配體片段中的一條巰基標(biāo)記，另一條核酸適配體片段延長(zhǎng)核苷酸序列，且延長(zhǎng)的核

6、酸序列能引發(fā)后續(xù)的HCR，從而使得大量的堿性磷酸酶通過生物素-親和素作用存在于電極表面，實(shí)現(xiàn)對(duì)ATP的高靈敏檢測(cè)，其檢測(cè)下限為0.2nM。
　　較多文獻(xiàn)指出傳統(tǒng)的分離式信號(hào)讀出方式在鏈置換擴(kuò)增信號(hào)放大檢測(cè)方法中存在“信號(hào)耗損”現(xiàn)象。針對(duì)該現(xiàn)象我們提出了一種集成式信號(hào)讀出生化分析傳感技術(shù)。第5章中，在同一條核酸序列上將信號(hào)傳導(dǎo)探針與目標(biāo)識(shí)別探針通過適當(dāng)?shù)募羟卸嗪统梢惑w，同時(shí)借助核酸外切酶Ⅲ信號(hào)放大方式，提高了G-四鏈體-血紅素脫氧

7、核酶催化H2O2氧化2，2'-聯(lián)氮基雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)檢測(cè)p53基因的效率，實(shí)現(xiàn)對(duì)p53基因定量比色分析。把G-四鏈體核酶的核苷酸序列與目標(biāo)識(shí)別序列揉和成一體，并且設(shè)計(jì)成分子信標(biāo)，這種模式具有極大的優(yōu)越性。此外，分子信標(biāo)對(duì)G-四鏈體的形成有協(xié)助功能，該方案目標(biāo)物響應(yīng)信號(hào)的生成更快，檢測(cè)范圍更寬，檢測(cè)靈敏度更好，其檢測(cè)下限達(dá)到1pM。第6章中，同樣基于集成式信號(hào)讀出方式，當(dāng)檢測(cè)物p53基因與未形成G-四鏈

8、體的分子信標(biāo)雜交時(shí)，富G堿基序列被釋放，生成G-四鏈體，同時(shí)形成新的分子信標(biāo)，使得聚合酶鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)發(fā)生，生成大量的G-四鏈體-血紅素脫氧核酶催化H2O2氧化ABTS，完成對(duì)p53基因超靈敏檢測(cè)，其檢測(cè)下限達(dá)到25fM。
　　第7章中，基于納米金團(tuán)聚策略，提出了一種G-四鏈體為傳導(dǎo)媒介可視化分析方法用于腫瘤突變p53基因測(cè)定。在該比色傳感器中，與靶DNA的雜交使得富G堿基發(fā)夾結(jié)構(gòu)的核酸鏈被強(qiáng)制打開，促進(jìn)高級(jí)結(jié)構(gòu)的同向平行G-四鏈