核酸適體分子識(shí)別和工具酶信號(hào)放大在生化分析中的應(yīng)用研究.pdf

1、核酸適體作為一種新型的分子識(shí)別工具，與靶分子之間分子識(shí)別功能與抗體極為相似.但適配體作用靶分子范圍極廣（包括毒素、免疫原性弱及不具有免疫原性的物質(zhì)），且具有核酸自身穩(wěn)定性強(qiáng)、變性復(fù)性快速可逆、易功能化修飾與標(biāo)記及作為優(yōu)良的納米器件等諸多優(yōu)點(diǎn).以核酸適體為識(shí)別分子的分析技術(shù)發(fā)展迅速。
　　 信號(hào)放大技術(shù)，尤其是利用工具酶結(jié)合其他分析檢測(cè)技術(shù)的信號(hào)放大技術(shù)，由于其方法簡(jiǎn)單，靈敏度和特異性高，反應(yīng)時(shí)間相對(duì)較短，近年來(lái)在痕量物質(zhì)分析方面

2、的得到了迅速發(fā)展。
　　 本文以鉀離子為研究模型，基于核酸適體和熒光探針技術(shù)，發(fā)展了兩種檢測(cè)小分子和蛋白質(zhì)檢測(cè)的分析方法；并且利用工具酶信號(hào)放大技術(shù)，發(fā)展了檢測(cè)單堿基多態(tài)性的新方法。從該思路出發(fā)，本文開(kāi)展了一下三方面的研究工作：
　　 1、基于核酸適體識(shí)別和芘分子熒光探針檢測(cè)鉀離子的研究
　　 本章基于核酸適體和芘分子基團(tuán)，研究了一種在均相中檢測(cè)鉀離子的簡(jiǎn)單方法。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下：以3’端修飾芘分子的核酸適體作為

3、分子識(shí)別元件，而在它的互補(bǔ)探針的5’端修飾芘分子，當(dāng)它們雜交后，形成芘激基二聚體，而在存在鉀離子時(shí)，互補(bǔ)探針與核酸適體解鏈，同時(shí)伴隨著485 nm處的芘激基二聚體的熒光峰降低。而在不存在鉀離子時(shí)，485 nm處的熒光峰不會(huì)發(fā)生變化。通過(guò)條件優(yōu)化，鉀離子的檢測(cè)的線性范圍為8.0×10-4～1.0×10-2 M，檢測(cè)限為6.0×10-4M。而且，在存在Na+、NH4+，Mg2+、Ca2+的生物流體中，仍然能對(duì)K+進(jìn)行高特異性檢測(cè)。
　

4、　 2、基于核酸適體和芘標(biāo)記分子信標(biāo)檢測(cè)鉀離子的研究
　　 本章中我們研究了一種新穎、靈敏的基于核酸適體和芘標(biāo)記的分子信標(biāo)對(duì)鉀離子檢測(cè)的方法。同樣，核酸適體做為分子識(shí)別元件，而兩端標(biāo)記芘分子的分子信標(biāo)作為信號(hào)轉(zhuǎn)換元件。在存在鉀離子時(shí)，分子信標(biāo)鏈與核酸適體解鏈，自身發(fā)生雜交，兩個(gè)芘分子相互靠近，形成芘激基二聚體，在485 nm處產(chǎn)生熒光峰，熒光峰的強(qiáng)度與加入鉀離子的量有關(guān)。而不存在鉀離子時(shí)，只在395 nm處有熒光峰。在優(yōu)化條件

5、下，485 nm熒光峰的強(qiáng)度與鉀離子的濃度在6.0×10-4M～2.0×10-2M，檢測(cè)限為4.0×10-4M。在存在不同濃度Na+、NH4+，Mg2+、Ca2+情況下，對(duì)鉀離子檢測(cè)仍然有很高的特異性。
　　 3、基于工具酶信號(hào)放大化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)單堿基突變
　　 由于T4DNA連接酶可以將ds-DNA分子連接起來(lái)，而DNA聚合酶可以使DNA從5’→3’聚合?；谶@這兩種工具酶的特殊性質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)單堿基突變位點(diǎn)為T(mén)4 D