脂質(zhì)體納米探針的構(gòu)建及信號放大策略在生物分子檢測中的應(yīng)用研究.pdf

1、近年來，在生命分析化學(xué)領(lǐng)域中，對生物分子的檢測方法要求越來越高，構(gòu)建對生物大分子簡單快速、靈敏精確、經(jīng)濟實惠、便捷有效的檢測策略已成為生命分析科學(xué)領(lǐng)域中研究的重點和熱點。
　　生物分子信號放大技術(shù)在各種工具酶和納米磁球等生物材料的基礎(chǔ)上發(fā)展起來，它是一種前沿的分析技術(shù)，被廣泛地應(yīng)用于生物分子的檢測。血糖儀（PGM）是床邊檢測儀器（Point-of care testing POCT)的一個重大突破，它不僅能夠方便地為家庭商購獲得，

2、而且檢測過程還脫離了實驗室的條件和儀器操作。由于它的便攜式“袖珍“尺寸、成本劃算、定量測定可靠、操作簡單和即時得出結(jié)果等優(yōu)點已經(jīng)被廣泛應(yīng)用。脂質(zhì)體具有理想的生物相容性和巨大的內(nèi)部空腔，可以包封大量的生物分子設(shè)計成納米探針。因此，我們設(shè)計了以工具酶和納米磁球等為材料的熒光信號放大策略，并構(gòu)建出以多功能脂質(zhì)體納米探針為基礎(chǔ)的PGM檢測策略，實現(xiàn)了生物大分子的靈敏、經(jīng)濟、精確、便攜檢測。
　　本論文分別利用PGM檢測和熒光檢測兩種檢測手

3、段，主要以Dam甲基轉(zhuǎn)移酶、磷脂酶D為研究對象，構(gòu)建了多種新的信號放大檢測技術(shù)平臺，實現(xiàn)了其定量分析。主要內(nèi)容包括：
　　1、基于目標物控制脂質(zhì)體“開-關(guān)”的級聯(lián)放大策略構(gòu)建靈敏精確檢測乳腺癌細胞中磷脂酶D的新方法
　　本章主要是基于目標物控制脂質(zhì)體（TCGL）“開-關(guān)”的級聯(lián)放大策略，用PGM對磷脂酶 D進行定量檢測。首先，我們將葡糖淀粉酶包裹于脂質(zhì)體之中，無需對葡糖淀粉酶進行標記，省去了標記的復(fù)雜過程，保持了酶的原有生物

4、活性。其次，檢測過程中使用便攜式定量設(shè)備血糖儀，繞開了對復(fù)雜儀器的需求以及相應(yīng)的復(fù)雜操作，使我們的方法可以簡單、靈活地應(yīng)用于原位檢測。該方法對磷脂酶 D的檢測限達到0.005 U L-1。此外，我們進一步在乳腺癌細胞中對磷脂酶D實行活性檢測并且做了抑制劑藥物篩選實驗，都取得了很好的效果。
　　2、基于磁球/脂質(zhì)體雜交探針構(gòu)建血糖儀靈敏便攜檢測DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的新方法
　　本章以磁球/脂質(zhì)體雜交探針為基礎(chǔ)，構(gòu)建了一種以PGM為

5、檢測工具，簡單便攜、靈敏度高、特異性強的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性檢測以及抑制劑篩選的新方法。首先，我們將p1DNA功能化的磁球與p2DNA功能化的包裹葡糖淀粉酶的脂質(zhì)體（GEL）雜交制備磁球-脂質(zhì)體雜交探針。然后，在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的存在下，雜交探針被甲基化，進一步被對甲基化位點敏感的限制性內(nèi)切酶Dpn I切割，通過磁分離，脂質(zhì)體從磁球上分離下來。最后，用1％的Triton X-100溶液對分離下來的脂質(zhì)體進行裂解，釋放出葡糖淀粉酶，葡糖淀

6、粉酶將信號底物淀粉催化水解，產(chǎn)生大量的葡萄糖，隨之用血糖儀對葡萄糖進行定量檢測，檢測限達到2.0×10?4 U mL?1。此外，我們進一步在人血清中進行了Dam甲基轉(zhuǎn)移酶的活性檢測實驗，取得了較好的結(jié)果。
　　3、基于磁性納米顆粒協(xié)同核酸外切酶III輔助的循環(huán)放大構(gòu)建靈敏精確檢測DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的新方法
　　本章構(gòu)建了一種Dam甲基轉(zhuǎn)移酶活性檢測的熒光磁性生物傳感器，這種傳感器基于磁性納米粒子協(xié)同核酸外切酶III輔助的循環(huán)指