量子點—生物分子復(fù)合探針的構(gòu)建及其在生物分析中的應(yīng)用.pdf

1、量子點是一種新型的半導(dǎo)體納米顆粒,是納米生物光子學(xué)重要的工具之一。量子點作為一種極具應(yīng)用前景的信號探針,與傳統(tǒng)有機熒光染料相比,具有寬而有效的激發(fā)譜,窄而對稱的發(fā)射譜,高的熒光量子效率,優(yōu)異的光化學(xué)穩(wěn)定性,方便靈活的表面可修飾性,以及發(fā)射波長尺寸可調(diào)等優(yōu)點。基于這些獨特的光學(xué)性質(zhì),結(jié)合先進的分析檢測技術(shù)和平臺,量子點在生物分析中的應(yīng)用日益廣泛,包括細胞與組織標(biāo)記、生物分子跟蹤與檢測、免疫反應(yīng)分析等方面,并取得了許多重要成果。但是,縱觀量

2、子點在生物分析領(lǐng)域的應(yīng)用,大部分的機理都是基于生物分子之間的特異性相互作用。因此,構(gòu)建量子點.生物分子復(fù)合探針,使量子點具有特異性靶向作用的同時,保持其熒光強度和穩(wěn)定性,并且盡量減少其他生物分子的非特異性吸附,這對于量子點在生物領(lǐng)域的應(yīng)用,起著尤為關(guān)鍵的作用。
　　隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展,醫(yī)學(xué)檢測中要求化驗和檢驗的儀器具有更高靈敏度、更短檢測時間、更小體積、便攜化。而新近發(fā)展起來的生物芯片技術(shù),即微流控芯片技術(shù)所具有的優(yōu)點能夠很好

3、地滿足這些要求。目前,微流控芯片主要應(yīng)用于基因測序、蛋白質(zhì)圖譜分析等高、精、尖領(lǐng)域。隨著微流控芯片技術(shù)的不斷成熟和制作成本的不斷降低,必將大規(guī)模地進入到常規(guī)醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域,取代那些笨重而且操作復(fù)雜的化驗、檢驗設(shè)備,進而促進醫(yī)療水平的進步。然而,目前微流控芯片的檢測靈敏度和特異性仍然有待提高。
　　我們課題組在水相合成高性能量子點方面有很好的基礎(chǔ),利用微波輔助水相量子點制備技術(shù),制備了優(yōu)良性能的水分散性量子點?；谶@個優(yōu)勢,我們試圖開

4、展一些原創(chuàng)性、有實際意義的研究工作,將量子點信號探針和微流控芯片檢測平臺相結(jié)合,充分發(fā)揮兩者的優(yōu)勢,克服彼此的缺陷:即量子點優(yōu)異的熒光性能,有助于提高微流控芯片的檢測靈敏度,并擴大其應(yīng)用范圍;微流控芯片技術(shù)的可控性、高通量,有利于提升量子點探針的標(biāo)識能力。本文構(gòu)建了一系列性能優(yōu)良的量子點.生物分子復(fù)合探針,并將這些復(fù)合探針用于微流控芯片,對生物分子進行檢測。具體研究內(nèi)容如下:
　　1.構(gòu)建了一種新型的微流控芯片檢測體系。
　

5、　這種微流控芯片是由PDMS片層和芯片基片組成。借助此微流控技術(shù)平臺,實現(xiàn)了生物分子在固相表面的固定組裝、識別、捕獲、檢測等一系列的生物反應(yīng)過程。此芯片制作成本低,易于操作,可實現(xiàn)不同種類、不同濃度的生物分子在微流控芯片上的快速分析。與傳統(tǒng)的微陣列芯片相比,這種微流控芯片技術(shù)能夠更好地保持生物分子的活性,樣品消耗量很少,不需要昂貴的點樣儀,對環(huán)境也沒有嚴(yán)苛的要求,并且流體具有可控性,有利于提高生物分子之間的結(jié)合效率,提高檢測靈敏度和特異

6、性。
　　2.構(gòu)建了量子點一親和素復(fù)合探針,并將這種探針用于微流控蛋白質(zhì)芯片。
　　基于靜電相互作用,將帶相反電荷的量子點和親和素自組裝,形成了量子點-親和素復(fù)合探針,并將這種納米生物復(fù)合探針作為信號探針,用于微流控蛋白質(zhì)芯片,對腫瘤標(biāo)志物進行檢測。通過實驗條件的不斷改進和優(yōu)化,克服了PDMS微通道和基片對蛋白質(zhì)的非特異性吸附,減小了量子點對蛋白質(zhì)的非特異性吸附,降低了芯片的背景信號,提高了量子點在芯片上的信號強度。實驗結(jié)果

7、表明,相對于傳統(tǒng)的熒光染料(FITC),采用量子點作為信號探針,無論是信號強度,信號穩(wěn)定性,還是檢測靈敏度,都有明顯的提高。這是首次將量子點引入到微流控蛋白質(zhì)芯片中。量子點在微流控芯片上的優(yōu)異表現(xiàn),證實了我們所構(gòu)建的檢測體系,充分地融合了量子點和微流控技術(shù)的優(yōu)勢,為蛋白質(zhì)的檢測和分析提供了一個新穎而有效的途徑。
　　3.構(gòu)建了量子點.免疫球蛋白復(fù)合探針,并將這種探針用于微流控蛋白質(zhì)芯片。
　　基于共價偶聯(lián)的機理,將量子點和免

8、疫球蛋白(羊抗鼠二抗)連接,形成了量子點-免疫球蛋白復(fù)合探針。詳細地探討了共價連接對量子點熒光強度和穩(wěn)定性的影響,制備得到了有效且穩(wěn)定的量子點生物探針。本文將這種量子點生物探針,用于微流控蛋白質(zhì)芯片,采用夾心免疫分析法,實現(xiàn)了緩沖液和血清中腫瘤標(biāo)志物的高特異性、高靈敏度檢測;采用反相免疫分析法,實現(xiàn)了混合樣品的多元檢測和多色成像。對于真實樣本和復(fù)雜樣本的有效檢測,預(yù)示著這種檢測體系在臨床檢測和蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域具有強大的應(yīng)用潛力,為理論

9、研究向?qū)嶋H應(yīng)用轉(zhuǎn)換提供了有利的技術(shù)支撐。
　　4.構(gòu)建了量子點-DNA-生物素-鏈霉親和素復(fù)合探針,并將這種探針用于微流控蛋白質(zhì)芯片。
　　本文提出了一種新型的以DNA作為“橋梁”的蛋白質(zhì)在量子點表面可控組裝的策略。作為驗證實驗,我們設(shè)計并制備了量子點-DNA-生物素-鏈霉親和素(QD-DNA-biotin-STV)納米生物復(fù)合物。實驗表明,組裝得到的復(fù)合物具有很高的熒光強度、穩(wěn)定性,以及生物分子的活性。將這種量子點復(fù)合探針

10、作為信號探針,用于微流控蛋白質(zhì)芯片,實現(xiàn)了腫瘤標(biāo)志物的高特異性、高靈敏度檢測。檢測限達到50fM,比有機熒光染料的檢測限低4個數(shù)量級;比量子點.親和素復(fù)合探針的檢測限低一個數(shù)量級。這種組裝策略避免了對量子點和生物分子的破壞,非常溫和、可控、有效,具有很高的普適性,將在生化分析和臨床應(yīng)用中有廣泛的應(yīng)用前景。
　　5.構(gòu)建了量子點-DNA復(fù)合探針,并將這種探針用于微流控DNA芯片。
　　基于配體交換的原理,巰基修飾的DNA部分取

11、代量子點表面的巰基配體,制備得到量子點-DNA復(fù)合探針。通過控制組裝條件,得到了不同組裝密度的量子點-DNA復(fù)合探針。構(gòu)建了基于雙色量子點的FRET體系,實現(xiàn)了靶DNA均相檢測。首次將量子點-DNA探針應(yīng)用于微流控DNA芯片,實現(xiàn)了靶DNA的非均相檢測。實現(xiàn)結(jié)果表明,檢測具有比較高的靈敏度,檢測限達到了50fM。除此之外,這種檢測體系能夠有效地區(qū)分完全互補序列、單堿基錯配、非互補序列,具有很強的特異性和選擇性,為DNA的檢測提供了一種全

12、新而有效的檢測途徑。
　　6.發(fā)展了一種基于量子點的葡萄糖非標(biāo)記檢測法。
　　首先證實了過氧化氫對量子點的熒光淬滅效應(yīng)?；谄咸烟茄趸笇ζ咸烟堑难趸呋磻?yīng),伴隨有過氧化氫生成,因此通過監(jiān)測量子點熒光強度的變化,檢測葡萄糖的濃度。實驗表明,這種檢測方法對濃度為微摩爾/升到毫摩爾/升的葡萄糖都能有效地檢測,檢測限為1.8μM。另外,基于同樣的檢測原理,采用96孔板作為檢測平臺,實現(xiàn)了標(biāo)準(zhǔn)樣品和血液樣本中葡萄糖的檢測。檢測結(jié)果