基于配體的朊病毒蛋白分析新方法.pdf

1、朊病毒病(priondiseases)是一類致死性神經(jīng)退行性疾病，是細胞型朊蛋白(cellularprionprotein，PrPC)經(jīng)構(gòu)象轉(zhuǎn)變形成致病型朊蛋白(scrapie prion protein，PrPSc)的結(jié)果。上世紀末歐洲瘋牛病的大范圍爆發(fā)及其由牛傳染給人的新型克雅氏病的發(fā)現(xiàn)使得人們“談牛色變”，并迫使歐盟迅速建立朊病毒病檢測的標準方法。朊病毒病的診斷尤其是早期診斷既能實現(xiàn)該疾病流行趨勢的監(jiān)控、確保肉類產(chǎn)品、輸血、手術(shù)、

2、血庫和血漿產(chǎn)品安全，又使得該病在永久性腦損傷發(fā)生前即可進行有效治療。基于朊病毒病抗體的傳統(tǒng)檢測方法因抗體制備復(fù)雜、與靶物的親和力和特異性不高等缺點而無法應(yīng)用于朊病毒病的早期診斷中。因此簡單、快速、準確的朊病毒病早期診斷方法亟待建立。朊病毒蛋白配體因能夠特異性的與朊蛋白相互作用而得到科學(xué)工作者的廣泛關(guān)注。如適配子是一類新興的與靶物具有很高的親和力和選擇性的核酸配體，自發(fā)現(xiàn)以來就因具抗體無法比擬的優(yōu)勢成為抗體替代物在各個領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。本

3、文將配體應(yīng)用于朊病毒病分析中，建立了一系列基于配體的朊病毒蛋白分析方法。主要研究內(nèi)容如下：
　　 1.單標記aptamer分子燈標的設(shè)計及朊蛋白的檢測中。根據(jù)G堿基在距離適當時能猝滅染料如羅丹明、熒光素等的熒光的性質(zhì)，本文設(shè)計了基于G堿基猝滅的單標記適配子分子燈標，成功解決了分子燈標雙標記的操作復(fù)雜、成本高、適配子親和力下降等問題。將所設(shè)計的適配子分子燈標應(yīng)用于朊病毒蛋白檢測時發(fā)現(xiàn)，在朊病毒蛋白濃度為1.1-44.7μg/mL時

4、，熒光強度與蛋白濃度呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系，檢測限為0.3μg/mL(3σ)。與傳統(tǒng)的抗體檢測方法相比，本文所建立的方法簡單、快速且選擇性高。
　　 2.基于適配子和汞離子的朊蛋白免標記檢測。根據(jù)T堿基能與Hg相互作用形成T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)的特點，本文建立了基于適配子和Hg2+的免標記的朊病毒蛋白檢測方法。研究結(jié)果表明，適配子與Hg2+作用后形成鏈間雙鏈結(jié)構(gòu)，引起雙鏈嵌入熒光染料SyberGreenⅠ的熒光顯著增強；但當加入朊病毒

5、蛋白后，朊病毒蛋白與適配子的特異性相互作用促使T-Hg-T結(jié)構(gòu)打開從而雙鏈結(jié)構(gòu)被破壞，SyberGreenⅠ的熒光降。當朊蛋白濃度為13.0-156.0nmol/L時，SyberGreenⅠ的熒光強度與朊蛋白濃度呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系，線性方程為IF-F0=58.33-8.42cPrP，相關(guān)系數(shù)R=0.992。
　　 3.雙適配子策略在多靶物分析中的應(yīng)用。與單適配子策略相比，雙適配子策略具有更高的選擇性和靈敏度，并能顯著提高分析方法

6、靈敏度。本研究將雙適配子策略應(yīng)用于多靶物分析中并選擇凝血酶、腺苷、朊病毒蛋白(PrP)三種與疾病相關(guān)的生物分子作為研究對象。結(jié)果表明，雙適配子策略能夠?qū)崿F(xiàn)同一樣品中凝血酶、腺嘌呤核苷酸和朊蛋白的同時檢測，且三種靶物的類似物如鳥嘌呤核苷酸、胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、IgG、蝸牛酶、牛血清白蛋白等對多靶物測定不產(chǎn)生干擾，顯示出雙適配子策略在多靶物分析中的高選擇性。
　　 4.雙適配子分子邏輯門在朊病毒蛋白構(gòu)象區(qū)分中的應(yīng)用。作為邏輯

7、門延伸的分子邏輯門以一個或多個復(fù)雜的生物或化學(xué)反應(yīng)過程為輸入信號，通過一定的邏輯運算簡化為單一輸出結(jié)果，例如疾病的診斷通過分子邏輯門可簡化為“患病”或“正?！?。本文借助分子邏輯門的優(yōu)勢并將雙適配子策略應(yīng)用其中，成功構(gòu)建了能夠進行“異或”(XOR)和“或”(OR)邏輯運算的雙適配子分子邏輯門。結(jié)果表明，PrPC符合“異或”邏輯運算而PrPRes符合“或”邏輯運算。與傳統(tǒng)的朊病毒蛋白區(qū)分方法相比，本文所構(gòu)建的雙適配子分子邏輯門具有四個優(yōu)點：

8、(1)雙適配子分子邏輯門非常簡單且能夠應(yīng)用于朊病毒蛋白不同構(gòu)象的區(qū)分；(2)使用雙適配子策略使得分子邏輯門具有極高選擇性，無需分離和純化即可實現(xiàn)血清中的朊病毒蛋白的區(qū)分；(3)雙適配子分子邏輯門的輸入信號(PrP和鹽酸胍)和元件(MMPs-Apt1和QDs-Apt2)的成本較低，且都是化學(xué)穩(wěn)定分子，而這是構(gòu)建更快、更高效、更小型的計算器所必需的；(4)因Apt1只在磁微米粒子表面形成單層而不涉及固定構(gòu)象，所以元件之一的MMPs-Apt1

9、能夠通過簡單的方法進行循環(huán)使用。
　　 5.肝素鈉誘導(dǎo)朊病毒蛋白構(gòu)象變化的光譜分析。粘多糖是一種在細胞膜表面和溶酶體中均有表達的朊蛋白配體分子，其在朊病毒病中發(fā)生中所發(fā)揮的作用目前仍存在爭議。本文以肝素鈉作為粘多糖的代表，通過共振光散射光譜、熒光光譜和圓二色光譜的變化研究了肝素鈉與人重組細胞型朊蛋白(rhPrPC23-231)的相互作用。結(jié)果表明，肝素鈉與朊蛋白相互作用后光散射和熒光信號均得到增強，且當rhPrPC23-231濃

10、度為0.41-16.46μg/mL時，rhPrPC23-231濃度與共振散射光強度呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系，線性方程：IRLS=183.84+272.40crhPrPC23-231，相關(guān)系數(shù)R=0.999。同時對朊蛋白和肝素鈉相互作用體系的熒光壽命表征表明，肝素鈉促使朊蛋白的熒光壽命有一定程度的延長，而圓二色光譜的表征則表明肝素鈉能誘導(dǎo)朊蛋白從富含α-螺旋的構(gòu)象向富含β-折疊的構(gòu)象轉(zhuǎn)變。
　　 本研究基于配體所建立的一系列朊病毒蛋白分