丙型肝炎病毒的檢測及基因分型新方法.pdf

1、丙型肝炎病毒(HCV)在全世界約有1.7億感染者，由于其疫苗難以研制且尚無特效藥，因此，對丙型肝炎的早期診斷是非常有意義的。現階段對丙肝的常規(guī)診斷方法為PCR與ELISA，二者雖屬于成熟的檢測方式，但均較為耗時，操作繁瑣，HCV的檢測急需簡便且靈敏的方法。
　　 本文利用分子信標與金納米顆粒針對HCV病毒RNA做了一系列檢測及基因分型的實驗。首先是使用Duplex-specific nuclease(DSN)作為分子信標的信號放

2、大工具，針對HCV RNA做了直接檢測。同時，還有利用該探針對HCV RNA的PCR產物進行檢測達到基因分型目的的實驗。另外，應用金納米顆粒，我們對HCVRNA做了靈敏而簡易的檢測。
　　 (1)通過DSN對MB與RNA的雜交產物進行酶切，可實現RNA的重復利用，雜交信號得到了放大。DSN能將MB的檢測靈敏度提高2000倍以上。對于JFH1RNA標準樣品，我們在較低的濃度下將其檢測了出來。然后，實驗檢測了huh7.5陽性細胞的R

3、NA。對于血清RNA樣品，此體系也能區(qū)分其陰性與陽性，且信號強弱與ELISA結果一致。
　　 (2)利用MB對PCR產物進行檢測，即可知道模板除開引物外，其他位置的序列。本文找到了適當的MB檢測雙鏈DNA(dsDNA)即PCR產物的方法和條件，以HCV的兩種亞型，JFH1與H77S病毒基因相差較大的部分為靶點設計探針，將二者區(qū)分開來。分子信標同雙鏈DNA分子中與之互補的一條進行雜交，可在對病毒RNA PCR反應過后，較為簡便地對

4、其基因亞型進行確認。
　　 (3)在鹽溶液中，金納米顆粒需要大量吸附單鏈DNA(ssDNA)在其表面才能保持膠體狀態(tài)。當體系內有ssDNA的互補RNA與其雜交時，則金顆粒會發(fā)生團聚。利用ssDNA、金納米顆粒、鹽溶液三者，便可在有無HCVRNA存在時分別觀察到金納米顆粒的變色（聚沉）以及不變色的現象，另外，將反應后的溶液在紫外-可見分光光度計中檢測金納米顆粒特有吸收峰的峰值，可更精確更靈敏地實現對HCV RNA的檢測。