微分離分析新方法研究.pdf

1、分析體系的微型化是現(xiàn)代分析化學(xué)發(fā)展的一個重要方向。為了提高分析的靈敏度和通量，滿足現(xiàn)場實時分析的需要，降低分析成本和樣品消耗量，發(fā)展微量化、集成化的分析方法已成為當(dāng)前研究的前沿領(lǐng)域。微流控芯片技術(shù)是上世紀(jì)九十年代初發(fā)展起來的一門新興技術(shù)，因其具有樣品消耗小、分析速度快、易實現(xiàn)陣列化和集成化的優(yōu)點而吸引了研究者的廣泛關(guān)注，成為微型化分析領(lǐng)域中的研究熱點。本論文的研究目的，一是要拓展基于微流控電泳芯片的新分離方法，二是要為實現(xiàn)微流控集成化分

2、析提供基礎(chǔ)。圍繞這兩個目的，本論文主要進(jìn)行了基于微流控芯片電泳的多維分離方法研究和基于毛細(xì)管的樣品預(yù)處理、分離和檢測集成化分析方法研究，全文共分五章，主要內(nèi)容如下： 第一章為文獻(xiàn)綜述，詳細(xì)介紹了微分析技術(shù)的現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢。從微通道分離、檢測和樣品預(yù)處理等方面展開綜述，介紹了毛細(xì)管液相色譜和毛細(xì)管電泳兩大微分離手段以及微通道多維分離方法，概述了能夠用于微通道檢測的激光誘導(dǎo)熒光(LIF)、電化學(xué)和質(zhì)譜(MS)等多種檢測技術(shù)，總結(jié)了微

3、通道中的樣品純化、富集和衍生等預(yù)處理方法。最后，闡述了本論文的研究背景和選題意義。 第二章首次建立了毛細(xì)管液相色譜和微流控芯片電泳聯(lián)用的新型二維分離系統(tǒng)。多維分離是增強(qiáng)分離體系峰容量的強(qiáng)有力手段，本研究的創(chuàng)新之處，就是將微流控芯片電泳應(yīng)用到液相色譜和電泳聯(lián)用的二維分離模式中，既發(fā)揮了毛細(xì)管液相色譜和芯片電泳各自的分離優(yōu)勢，又解決了接口制作的難題。通過芯片上的小孔，第一維的液相色譜毛細(xì)管柱可以直接與芯片相連，第一維的分離產(chǎn)物連續(xù)進(jìn)

4、入芯片，依靠芯片上的交叉通道和電壓切換實現(xiàn)第二維的進(jìn)樣。該系統(tǒng)結(jié)合了毛細(xì)管液相色譜高效分離的優(yōu)點和微流控芯片電泳快速分離的特性，巧妙地利用了微流控芯片的交叉通道和電控進(jìn)樣方式，具有接口制作簡單、死體積小、操作便利、峰容量高的優(yōu)點。本章詳細(xì)描述了該二維系統(tǒng)的構(gòu)建方法，對兩維連接的實驗參數(shù)進(jìn)行了考察，獲得了蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物的全二維分離譜圖。 第三章發(fā)展了針對興奮劑的毛細(xì)管電泳分離．激光誘導(dǎo)熒光檢測(LIF)方法。 興奮劑的檢測

5、是微流控芯片分析技術(shù)的重要應(yīng)用領(lǐng)域。在興奮劑問題日益突出的今天，發(fā)展快速、微型化、自動化的興奮劑檢測新方法具有重要意義。在微流控芯片上實現(xiàn)尿樣中興奮劑的樣品預(yù)處理、分離和檢測集成化分析，將為實現(xiàn)興奮劑的高通量和高靈敏度檢測提供新的途徑。毛細(xì)管具有與芯片微通道相近的內(nèi)徑尺寸，因此，基于毛細(xì)管的興奮劑分析方法是通往芯片集成化分析的橋梁和必經(jīng)之路。本研究的創(chuàng)新之處，就是針對將來芯片上的檢測要求，發(fā)展了高靈敏度的LIF直接檢測法和間接檢測法，為

6、芯片微通道里的刺激劑和利尿劑檢測提供了依據(jù)。在本章中，首先建立了LIF直接檢測的一般方法，構(gòu)建了包括自動進(jìn)樣器、分離毛細(xì)管和LIF檢測器的電泳分離／檢測體系，在此基礎(chǔ)上，建立了針對麻黃堿類刺激劑的直接LIF檢測方法。以熒光素異硫氰酸酯(FITC)為熒光衍生試劑，研究了麻黃堿、庚胺醇、去甲基偽麻黃堿等刺激劑的熒光衍生條件和毛細(xì)管電泳分離條件。由于直接檢測法對樣品結(jié)構(gòu)有一定要求，在尋求不到合適的衍生試劑時，間接檢測法作為一種通用檢測方法顯示

7、出了其優(yōu)越性。本章對用于間接LIF檢測的多種電泳緩沖體系進(jìn)行了考察，建立了以三乙胺／熒光素／正丁醇為緩沖體系的間接檢測方法，對尿液中的四種酸性利尿劑(依他尼酸、氯噻酮、布美它尼和芐氟噻嗪)進(jìn)行了分析。 第四章發(fā)展了毛細(xì)管柱內(nèi)的樣品預(yù)處理方法，主要是微通道固相萃取和固相衍生方法，并將之應(yīng)用于尿樣中麻黃堿類刺激劑的預(yù)處理。本章的創(chuàng)新之處在于：1)，實現(xiàn)了微通道中固相載體的定位。本章采用紫外光照聚合與勻漿填充法相結(jié)合的方法，在微通道中

8、的任意位置制備了用于樣品預(yù)處理的，長度可控的固相載體，制備方法簡便易行，無需采用復(fù)雜的微加工技術(shù)，為將來集成化芯片微通道中固相載體的定位提供了基礎(chǔ)。2)，提出了微通道中的多相載體技術(shù)，以此獲得較高的固相萃取和固相衍生效率。本章將多孔聚合物整體床與色譜填料相結(jié)合，制備了多孔聚合物單相柱、多孔聚合物／ODS雙相柱和多孔聚合物／GDX-502雙相柱等三種類型的毛細(xì)管預(yù)處理柱，對低濃度的麻黃堿進(jìn)行了預(yù)處理，結(jié)果表明雙相柱的預(yù)處理結(jié)果要優(yōu)于單相柱

9、。3)，發(fā)展了固相衍生技術(shù)，不僅獲得了優(yōu)于溶液衍生的衍生效果，同時也使固相萃取步驟與衍生步驟順利銜接，為微通道中的高效衍生提供了新的途徑。4)，首次提出了微波輔助固相衍生方法，將高效的固相反應(yīng)與快速的微波輔助反應(yīng)相結(jié)合，使FITC的衍生反應(yīng)由十幾小時縮短至幾分鐘，大大提高了樣品預(yù)處理的速度。圍繞樣品的純化、富集和衍生，本章探討了不同類型的預(yù)柱對簡單背景(水溶液)和復(fù)雜背景(尿樣)中麻黃堿的預(yù)處理方法，確定了以多孔聚合物／GDX-502雙

10、相柱對尿液中的麻黃堿進(jìn)行預(yù)處理的最終技術(shù)路線。結(jié)果表明，該固相萃取和固相衍生方法能夠很好地匹配后續(xù)毛細(xì)管電泳分離和激光誘導(dǎo)熒光檢測，可檢出尿樣中10ng的麻黃堿。該研究為將來興奮劑的集成化微流控芯片分析奠定了基礎(chǔ)。 第五章對基于毛細(xì)管柱的蛋白質(zhì)固相測序新方法進(jìn)行了初步研究。蛋白質(zhì)的氨基酸排列順序一直是生命科學(xué)研究的重要內(nèi)容，在蛋白組學(xué)研究蓬勃發(fā)展的今天，尤其需要發(fā)展多種技術(shù)平臺，對微量蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確、快速和靈敏的序列分析?，F(xiàn)有的

11、蛋白質(zhì)測序方法中，最為成熟并廣泛應(yīng)用的是Edman氮端降解測序法。本章的主要工作就是探討Edman降解測序法在微通道中實現(xiàn)的可能性，將包括多個反應(yīng)步驟的常規(guī)測序方法微型化，為將來在微流控芯片中實現(xiàn)Edman降解測序集成化方法提供基礎(chǔ)。為了實現(xiàn)微通道里的高靈敏度檢測，本研究對經(jīng)典Edman降解方法進(jìn)行了改進(jìn)，探索了以熒光試劑FITC為偶聯(lián)劑的降解反應(yīng)。本章詳細(xì)討論了該微分析方法的實施策略，初步確定了從微量蛋白質(zhì)的固定到轉(zhuǎn)化產(chǎn)物L(fēng)IF檢測的