基于功能化納米顆粒和仿生材料的生化分析新方法.pdf

1、利用免疫分析技術對復雜基質中的目標分析物進行高靈敏度和高選擇性的檢測，是現代生物化學和生物醫(yī)學研究領域中極具吸引力的熱點課題之一。特別是，在臨床醫(yī)學免疫診斷中，檢測病人樣品中的痕量疾病標志物對實現相關疾病的早期診斷、早期治療以及病因的探索具有極為重要的意義。目前免疫分析方法已有許多報道，但這些方法大多存在操作復雜耗時、通量低、儀器昂貴、試劑和樣品耗費量大、對操作人員要求較高的專業(yè)技能等諸多問題。因此，開發(fā)一些快速、高通量、低成本且易于臨

2、床推廣和現場應用的免疫分析新方法是一件很有價值的工作。此外，由于電化學酶生物傳感器具有靈敏度高、制造簡單、價格低廉等諸多特點，它們在生化分析中的應用受到了人們越來越多的關注。但是，酶生物分子固定化技術一直是制約這類微型分析裝置快速發(fā)展與廣泛應用的“瓶頸”。
　　 針對當前免疫分析方法和酶生物分子固定化平臺構建中存在的焦點和難點問題，本論文創(chuàng)新性地應用荷葉和貽貝仿生膜，并結合使用功能化生物納米顆粒，發(fā)展了一系列單/多組分免疫檢測新

3、方法以及基于新型生物分子固定化平臺設計的電化學酶生物傳感器，實現了對目標物的高靈敏測定。主要內容如下：
　　 （1）探尋有效的途徑用于降低昂貴的試劑和珍貴的生物樣品的用量，將有助于降低具有諸多優(yōu)點的懸浮免疫分析的檢測成本，使其更易于推廣應用。在第2章中，首次將荷葉仿生超疏水表面引入懸浮免疫分析平臺的設計。以聚碳酸酯為模型聚合物，通過選擇合適的溶劑和非溶劑，提出了一種基于非溶劑誘導相分離的超疏水表面制備新方法。結果表明，新方法可于

4、室溫下在多種材料基底表面上快速制備同時具有高的水的接觸角（約為160°）和低的水的滑動角（小于5°）的超疏水聚碳酸酯膜。該膜還具有良好的抗腐蝕性能和機械穩(wěn)定性。隨后，在普通檢測試管（即10 mL 離心管）內壁表面上修飾聚碳酸酯膜，首次制備了一種基于超疏水表面的懸浮免疫分析平臺（superhydrophobic surface-based suspensionimmunoassay platform，SSBSIP）。進而利用該新平臺，以人

5、免疫球蛋白G（IgG）為模型分析物，發(fā)展了一種基于金增強納米金標記信號放大的磁懸浮比色免疫分析新方法。研究結果表明，SSBSIP在輕微機械振蕩條件下即可實現懸濁反應溶液（如免疫磁探針與樣品）的最大限度的均勻混合，形成具有較高抗原-抗體結合效率和較快免疫反應動力學的“循環(huán)流動反應體系”?；赟SBSIP的新方法僅需較小的試劑和樣品用量（如單步免疫反應中僅需10 μL），可實現對人IgG的快速（如單步免疫反應僅需20 min）、高靈敏的比色

6、檢測，檢測下限約為25 ng/mL。此外，SSBSIP 還具有自清潔能力，可反復使用。
　　 （2）日本血吸蟲病是一種古老的地方性傳染疾病，嚴重威脅著廣大疫區(qū)人民的身體健康，成為世界上亟待解決的一個嚴重公共衛(wèi)生問題。在第3章中，應用開發(fā)的SSBSIP 新平臺，結合銅增強納米金標記信號放大策略，成功發(fā)展了一種磁電化學金屬免疫分析新方法，用于定量檢測感染兔血清中的日本血吸蟲抗體。研究結果表明，通過協(xié)同使用牛血清白蛋白-正常兔血清雙重

7、封閉試劑和免疫磁分離以將非特異性吸附影響降至最低，本方法可實現對濃度范圍在2 ng/mL～15 μg/mL的血吸蟲抗體的特異檢測，檢測下限約為1.3 ng/mL。與最近報道的其他血吸蟲抗體檢測方法相比，新方法在試劑和樣品用量、單步免疫反應時間、檢測下限等方面具有顯著優(yōu)勢。用于實際樣本分析時，該方法不僅能很好地鑒定血吸蟲感染血清的感染程度，而且可獲得與經典的酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）基本一致的結果，表明其可望用于日本血吸蟲病的臨床生化診

8、斷。
　　 （3）多組分免疫分析法，由于具有分析通量高、試劑和樣品消耗少、分析成本低等突出優(yōu)點，近年來成為免疫分析研究中的熱點之一。在第4章中，采用電化學沉積手段將廉價的鉛筆石墨上的石墨顆粒修飾上具有微米結構的金層，制備了由金修飾石墨顆粒構成的微電極陣列，進而將其應用于基于電化學阻抗圖譜的多組分免疫分析新方法研究。在單分析物實驗中，通過結合基于納米金的信號放大策略，使用該微電極陣列的阻抗免疫傳感器可實現對濃度范圍在0.05～10

9、0ng/mL的人IgG模型分析物的高靈敏檢測，檢測下限約為36 pg/mL。與使用普通金電極的情況相比，該傳感器的檢測靈敏度約高出三個數量級。此外，所引入的電位控制單分子層功能膜組裝（脫附）技術，可有效減少傳感器制備時間，并實現傳感界面的快速再生。多組分實驗證明，同時使用多個微電極陣列平臺可實現一個樣品溶液中多種蛋白質的近同時電化學阻抗檢測。
　　 （4）基于硝酸纖維素膜的免疫金（-金或銀）染色法具有諸多優(yōu)點，特別適于低收入地區(qū)

10、和發(fā)展中國家中的傳染病篩查以及蛋白質等生化物質的即時檢測和現場分析。但絕大多數的現有方法普遍存在一些問題，包括極低的硝酸纖維素膜利用率、不宜進行多組分同時分析和難以有效抑制“咖啡環(huán)效應”（導致所得環(huán)狀印跡不利于進行后續(xù)的準確定量分析）等。在第5章中，為了從根本上解決上述問題，實驗通過將硝酸纖維素膜陣列組裝于超疏水聚碳酸酯功能表面，開發(fā)了一種水溶液擴散局域化平臺（aqueous solution diffusion-localized p

11、latform，ASDLP），并將之用于發(fā)展基于免疫金-金染色的高靈敏的多組分同時比色檢測新方法。研究結果顯示，由于聚碳酸酯膜具有優(yōu)異的“排斥水（溶液）”的性質，試劑和樣品溶液的擴散被局限于親水硝酸纖維素膜表面，因而從根本上賦予了基于ASDLP的免疫金-金染色法各種優(yōu)點，包括硝酸纖維素膜具有100％的利用率、可用于多組分的同時比色檢測、可通過有效地抑制“咖啡環(huán)效應”獲得具有均勻形貌的印跡結果以利于后續(xù)的準確定量分析、非檢測區(qū)域（即白色的

12、聚碳酸酯膜）表現出較低的背景顏色信號、以及ASDLP可反復使用等。
　　 （5）在電化學酶生物傳感器的制備中，關鍵步驟之一就是采用合適的固定化技術把大量的酶生物分子穩(wěn)定地固定到換能器表面，并使其能保持良好的生物活性。在第6章中，合成了具有微/納階層結構的花簇狀氧化鋅顆粒，進而結合使用殼聚糖和納米金以構建辣根過氧化物酶的固定化平臺，發(fā)展了一種新的無電子媒介體H2O2生物傳感器?；ù貭钛趸\顆粒可為辣根過氧化物酶的固定提供較大的表面

13、積。殼聚糖和帶正電的氧化鋅顆粒，可分別通過物理包埋作用和靜電吸附，將大量的標記了辣根過氧化物酶的負電性的納米金組裝到電極表面。此外，具有優(yōu)異生物相容性和導電性的納米金不僅可以提高辣根過氧化物酶的負載量，而且可以很好地保持辣根過氧化物酶的生物活性，并有效促進酶與電極之間的電子傳遞。
　　 研究結果表明，通過氧化鋅顆粒和納米金的協(xié)同作用，發(fā)展的酶傳感器實現了對H2O2的快速、靈敏的直接電化學檢測，線性檢測范圍是1.5 μM～45 m

14、M，檢測下限約為0.7 μM。
　　 （6）基于聚合物包埋的酶生物分子固定技術具有許多優(yōu)點，但目前廣泛使用的各種聚合物材料（如殼聚糖）通常與基底電極的結合力較弱，容易導致固定的酶生物分子在洗滌和檢測過程中泄露。在第7章中，首次以貽貝仿生的高粘性聚多巴胺膜為功能基底膜并協(xié)同使用納米金，構建了一種具有高穩(wěn)健性能的酶生物分子固定化新平臺。進而以固定辣根過氧化物酶為例，發(fā)展了一種新的電化學酶傳感器用于H2O2的測定。結果表明，借助高生物