基于紙微流控分析裝置的功能核酸生化分析新方法研究.pdf

1、功能核酸是指能與高特異性結(jié)合特定目標物或具有某些催化功能的一類核酸分子。因具有優(yōu)異的生物相容性、靈活的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制且易于合成等優(yōu)點，近年來基于功能核酸的分子探針研究受到了國內(nèi)外研究者們的極大關(guān)注。大量基于功能核酸的新型生化分析方法與生物傳感器件被開發(fā)出來。盡管如此，現(xiàn)有絕大部分的這些功能核酸生化分析與生物傳感新技術(shù)要么不能實現(xiàn)定量分析，要么必須使用價格昂貴的定量分析設(shè)備。針對當(dāng)前功能核酸生物分析方法存在的帶共性問題，本論文嘗試引入低成本

2、紙微流控分析裝置，開展功能核酸免儀器定量分析新方法研究。主要研究內(nèi)容如下：
　　在第二章中，利用紙微流控分析裝置和G-四鏈體-氯化血紅素（hemin）DNA模擬酶，開發(fā)了一種簡單、低成本的K+免儀器計時定量檢測新方法。當(dāng)樣品中存在K+時，富含鳥嘌呤的特定序列單鏈DNA會發(fā)生構(gòu)象變化形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，進而與 hemin結(jié)合生成具有過氧化物酶活性的 DNA模擬酶。該模擬酶能夠催化 H2O2和固定在紙微流控分析裝置中的3,3’,5,5

3、’-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）之間的反應(yīng)，在紙中生成大量的疏水性聚合TMB沉積物。不同濃度的K+樣品將使得紙裝置中TMB固定處生成的疏水性聚合TMB沉積物的產(chǎn)量不同，從而導(dǎo)致滴加在紙裝置上的紅墨水流經(jīng)該處到達設(shè)定位置所需時間存在差異。通過使用計時器或具有計時功能的手機量測紅墨水的流過時間，即可實現(xiàn)樣品中K+濃度的免儀器定量分析。結(jié)果表明，在優(yōu)化的實驗條件下，新方法對K+檢測具有兩段線性范圍，分別是500 nM~25μM和25~200μM。根

4、據(jù)3σ規(guī)則得到方法的檢測下限為490 nM。此外，該方法還具有較理想的檢測特異性和重現(xiàn)性。將之用于實際人血清樣品分析，回收率結(jié)果令人滿意。
　　在第三章中，利用多通道紙微流控分析裝置發(fā)展了一種新型的核酸適配體免儀器即時（Point-of-Care，POC）定量分析方法。實驗中，協(xié)同使用雜交鏈式反應(yīng)和酶催化反應(yīng)作為級聯(lián)信號放大手段以提高分析靈敏度。通過使用磁分離技術(shù)來提高方法的檢測特異性。進而，利用酶催化產(chǎn)物H2O2可氧化μPAD中

5、KMnO4（檢測試劑）著色印跡使之褪色的反應(yīng)機制，建立了不需任何電子讀取的計數(shù)策略用于模型分析物（即腺苷）的肉眼定量檢測。實驗結(jié)果表明，建立的新方法僅要求操作者具有基本的溶液混合、磁分離、顏色辨別和計數(shù)能力，即可實現(xiàn)樣品中腺苷的免儀器POC定量分析。本研究中腺苷的線性檢測濃度范圍是1.1μM~17.5 mM，檢測下限為1.1μM。該方法具有操作簡單、成本低廉、分析靈敏/特異、便攜性好等突出優(yōu)點，為發(fā)展核酸適配體POC定量分析技術(shù)提供了一