基于衍生化技術的磷脂高效分析新方法及其應用研究.pdf

1、磷脂是生物體內(nèi)種類最多的一類脂質(zhì)，磷脂代謝與許多不同疾病如心血管疾病等密切相關，是重要的信號分子。通過了解磷脂化合物在生物體內(nèi)的代謝狀況，結合磷脂特有的生理功能，進而可全面深入地研究磷脂在生命活動過程中的作用，對脂質(zhì)組學及脂質(zhì)營養(yǎng)的研究具有重要的意義。但是PLs種類極為繁多，結構復雜，因此對生物體內(nèi)復雜磷脂類化合物的分析是一項非常有挑戰(zhàn)性的工作。
　　本課題以磷脂類化合物為研究對象，將體外化學衍生化技術與電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（ESI-M

2、S/MS）技術相結合，開展基于化學衍生化技術的磷脂高選擇性、高靈敏定性和定量分析新方法研究，以解決現(xiàn)有質(zhì)譜技術在磷脂分析檢測中存在的技術瓶頸。本論文研究結果如下：
　　1.建立了基于丙酮穩(wěn)定同位素標記技術相對定量分析磷脂酰乙醇胺（PE）的方法。通過丙酮穩(wěn)定同位素標記技術（ASID），結合DNLS-shotgun ESI-MS/MS技術使PE的分析靈敏度提高了2.2-2.5倍。通過d0-丙酮和d6-丙酮衍生化后產(chǎn)生的6Da質(zhì)量差實現(xiàn)

3、了單個PE分子種類的相對定量分析，為解決磷脂分析中定量難的瓶頸問題提供了新思路。應用所建方法，完成了對20％豬油高脂，20%橄欖油高脂喂養(yǎng)和正常飼料喂養(yǎng)大鼠肝臟中 PE分子的定性和相對定量分析，并通過多變量分析成功的找出了差異顯著的PE分子種類。分析結果對高脂膳食引發(fā)的慢性疾病相關脂質(zhì)類生物標志物的發(fā)掘具有指導意義。
　　2.丙酮雖然常見易得，但它只能針對PE、PS等含有氨基的磷脂種類進行衍生化反應。因此，本章又建立了一種基于甲基

4、化和同位素標記技術的磷脂高效定性定量分析方法。一方面通過“輕”，“重”標記后的目標分析物按等比例混合實現(xiàn)了PLs的相對定量分析；另一方面，通過以“輕”標記的磷脂標準品作為內(nèi)標，實現(xiàn)了PLs的絕對定量分析。此外，三甲基硅烷化重氮甲烷對磷脂甲基化后，PC、PE、PS、PA、PG和PI六類磷脂的檢測靈敏度分別提高了1.18-，10.21-，10.21-，14.03-，104.13-及7.28倍。通過基于混合模式固相萃取技術可快速分離血漿磷脂，

5、結合所建立的基于甲基化和穩(wěn)定同位素標記技術的磷脂高效高通量分析方法，對高血脂病人血漿中磷脂組分含量的變化進行分析。共鑒定出血漿中的33種PC，25種PE，22種PG，15種PS，17種PI和18種PA，且找出了30種具有顯著差異的磷脂分子種類。并進一步驗證了基于甲基化和同位素標記技術的磷脂相對定量和絕對定量分析方法的可行性和實用性。所建立的磷脂分析方法簡單實用，拓寬了內(nèi)標物的選擇范圍，對脂質(zhì)組學和脂質(zhì)化學與營養(yǎng)的研究都具有重要意義。

6、r>　　3.建立了結構磷脂的shotgun-MS分析方法。應用該方法結合單因素實驗和響應面實驗研究了酶法合成富含花生四烯酸結構磷脂的工藝。得出最佳的工藝條件為：反應溫度55.6℃，反應時間25.1 h，酶添加量15.3%，底物摩爾比1:10.1。在此最優(yōu)條件下，ARA結合率可達15.42%，富含ARA結構磷脂的產(chǎn)率為13.26%。并對合成產(chǎn)物中的卵磷脂（PC）分子種類進行了鑒定。該研究為富含n-6系列PUFA結構磷脂的營養(yǎng)學特性研究及相