核酸探針信號(hào)轉(zhuǎn)換及放大新方法研究.pdf

1、核酸分子探針作為近年來發(fā)展起來的新型生物分析工具，主要是以核酸序列作為基本組成單元，以堿基配對(duì)及其他作用方式作為識(shí)別動(dòng)力，最終以光、電等信號(hào)將探針與目標(biāo)物質(zhì)的相互作用輸出出來。核酸分子探針已經(jīng)成功應(yīng)用于生物小分子、核酸、蛋白質(zhì)及腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)中。然而，傳統(tǒng)的核酸分子探針與目標(biāo)物主要是基于1∶1結(jié)合比率下實(shí)現(xiàn)分子識(shí)別及信號(hào)轉(zhuǎn)換，因此在針對(duì)不同目標(biāo)物的生物分析中通常需要合成多種熒光或者其他信號(hào)報(bào)告分子功能化的核酸探針，這在一定程度上將會(huì)增加

2、實(shí)驗(yàn)繁瑣程度，提高實(shí)驗(yàn)成本。此外，這種1∶1的信號(hào)轉(zhuǎn)換方式也會(huì)將核酸探針的檢測(cè)靈敏度限制在一定范圍之內(nèi)。因此，核酸探針的通用性及高靈敏檢測(cè)仍然是科研工作者面臨的重要挑戰(zhàn)。為了解決這些問題，本論文結(jié)合核酸工具酶、利用主客體間相互作用，同時(shí)結(jié)合三鏈分子開關(guān)、DNA雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等構(gòu)建了一系列通用型核酸傳感平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)DNA、生物小分子及細(xì)胞的放大檢測(cè)，并將其進(jìn)一步擴(kuò)展至腫瘤細(xì)胞的靶向治療中。主要開展了以下幾方面的工作:
　　一、基于

3、鏈置換反應(yīng)設(shè)計(jì)構(gòu)象可轉(zhuǎn)換的核酸探針用于單堿基多態(tài)性的檢測(cè)主要以鏈置換放大反應(yīng)為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)了一種包含有發(fā)夾Ⅰ和發(fā)夾Ⅱ兩部分構(gòu)象可轉(zhuǎn)換核酸探針。在目標(biāo)序列不存在時(shí)，探針呈發(fā)夾構(gòu)象Ⅰ，此時(shí)結(jié)構(gòu)Ⅱ的莖部互補(bǔ)序列部分被包含在結(jié)構(gòu)Ⅰ的莖部?jī)?nèi),3'端為延長(zhǎng)的單鏈DNA序列。由于缺少聚合反應(yīng)的引物因此不能發(fā)生聚合反應(yīng)。加入目標(biāo)序列之后，發(fā)夾Ⅰ被打開，Ⅱ的莖部被釋放出來重新形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)并且3'端雜交成雙鏈充當(dāng)聚合反應(yīng)的引物。經(jīng)過反復(fù)多次的聚合置換即可以實(shí)

4、現(xiàn)目標(biāo)序列的高靈敏檢測(cè)。
　　二、基于主客體作用設(shè)計(jì)莖部性能可控的核酸探針用于目標(biāo)物的放大檢測(cè)在分子信標(biāo)兩末端分別標(biāo)記芘分子，通過向反應(yīng)體系中加入環(huán)糊精實(shí)現(xiàn)分子信標(biāo)熱穩(wěn)定性的調(diào)控及目標(biāo)物的信號(hào)放大檢測(cè)。芘分子與環(huán)糊精的包絡(luò)作用可以增加溶液中芘單體分子形成二聚體的機(jī)率，進(jìn)而調(diào)控分子信標(biāo)莖部的穩(wěn)定性，另外環(huán)糊精空腔內(nèi)的疏水性環(huán)境也可以有效的增強(qiáng)芘分子二聚體熒光。當(dāng)向反應(yīng)體系中加入待檢測(cè)物后，待檢測(cè)物與探針作用破壞其分子信標(biāo)構(gòu)象，此時(shí)末

5、端的芘分子脫離環(huán)糊精空腔，二聚體熒光降低，單體熒光上升，通過對(duì)整個(gè)過程中單體與二聚體熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換的監(jiān)測(cè)可以實(shí)現(xiàn)生物分子的高靈敏檢測(cè)。
　　三、基于DNA三鏈分子開關(guān)構(gòu)建熒光核酸檢測(cè)平臺(tái)實(shí)現(xiàn)多目標(biāo)物的檢測(cè)(1)結(jié)合穩(wěn)態(tài)熒光檢測(cè)技術(shù)實(shí)現(xiàn)溶液體系中多目標(biāo)物的檢測(cè)。選擇末端分別標(biāo)記芘的分子信標(biāo)作為信號(hào)報(bào)告探針，同時(shí)在核酸適體末端延長(zhǎng)T、C堿基作為捕獲探針，信號(hào)報(bào)告探針與捕獲探針在合適的pH條件下形成DNA三鏈分子開關(guān)結(jié)構(gòu)，此時(shí)信號(hào)探針兩端

6、標(biāo)記的芘分子相互遠(yuǎn)離，核酸適體序列暴露在外面進(jìn)行目標(biāo)物的識(shí)別。加入目標(biāo)物后，目標(biāo)物與核酸適體作用，破壞三鏈結(jié)構(gòu)，釋放出信號(hào)報(bào)告探針。通過監(jiān)測(cè)芘分子穩(wěn)態(tài)熒光的信號(hào)變化實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的定量檢測(cè)。另外，在不同目標(biāo)物存在時(shí)，只需要改變核酸適體序列即可實(shí)現(xiàn)多組份分析，檢測(cè)體系成本低，通用性好。
　　(2)結(jié)合時(shí)間分辨熒光技術(shù)實(shí)現(xiàn)復(fù)雜體系中汞離子(Hg2+)的檢測(cè)。首先在磁納米顆粒表面構(gòu)建三鏈分子開關(guān)，以富T的DNA序列作為Hg2+識(shí)別單元，雙芘

7、標(biāo)記的分子信標(biāo)作為信號(hào)報(bào)告探針。在Hg2+存在下，三鏈結(jié)構(gòu)破壞，捕獲探針與信號(hào)報(bào)告探針分離，釋放出的信號(hào)探針形成雙鏈分子信標(biāo)，其兩端標(biāo)記的芘分子靠近形成二聚體熒光。Hg2+與捕獲探針結(jié)合后通過磁分離可以進(jìn)一步避免Hg2+對(duì)芘二聚體熒光的淬滅作用，因此利用時(shí)間分辨熒光技術(shù)作為信號(hào)輸出手段可以實(shí)現(xiàn)復(fù)雜體系中Hg2+的檢測(cè)。
　　四、基于DNA三鏈分子開關(guān)構(gòu)建表面增強(qiáng)拉曼核酸檢測(cè)平臺(tái)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的放大檢測(cè)(1)結(jié)合前面提出的DNA三鏈分子

8、開關(guān)，利用生物分子與核酸適體特異性結(jié)合引起銀納米顆粒與金膜基底之間的距離變化，從而導(dǎo)致拉曼“熱點(diǎn)”效應(yīng)的產(chǎn)生，由此實(shí)現(xiàn)銀納米顆粒表面功能化的拉曼報(bào)告分子的信號(hào)增強(qiáng)。同時(shí)，當(dāng)向體系中加入三鏈分子開關(guān)的捕獲探針時(shí)，銀納米顆粒與金膜基底的距離變大，促使拉曼增強(qiáng)信號(hào)減弱，整個(gè)過程可以實(shí)現(xiàn)生物分子的高靈敏檢測(cè)及拉曼活性基底的循環(huán)再生利用。
　　(2)如前幾章所述構(gòu)建三鏈分子開關(guān)作為分子識(shí)別部分，在目標(biāo)物存在下，三鏈分子開關(guān)被打開釋放出信號(hào)報(bào)

9、告探針引發(fā)DNA雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。由于雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)形成的長(zhǎng)鏈DNA上修飾有很多巰基基團(tuán)，當(dāng)向其中加入拉曼信號(hào)分子功能化的金納米顆粒后，大量金納米顆粒通過“金-巰”鍵作用連接至長(zhǎng)鏈DNA上并呈聚集狀態(tài)。此時(shí)，相鄰金納米顆粒之間的“熱點(diǎn)”作用大大加強(qiáng)，其表面功能化的拉曼信號(hào)分子產(chǎn)生局部磁場(chǎng)引起化學(xué)鍵的振動(dòng)，從而產(chǎn)生很強(qiáng)的拉曼信號(hào)。因此可以實(shí)現(xiàn)多目標(biāo)物的拉曼放大檢測(cè)。
　　五、基于DNA雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)構(gòu)建功能小分子的高效核酸探針輸送平臺(tái)將雜交