新型菁類G-四鏈體熒光探針的設(shè)計(jì)與性能研究.pdf

1、G-四鏈體核酸在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中起重要的角色，使其成為抗腫瘤藥物研發(fā)的重要靶標(biāo)。但是，關(guān)于G-四鏈體在細(xì)胞環(huán)境中的真實(shí)存在狀態(tài)，以及它在細(xì)胞環(huán)境下分布、形成及解鏈過程等方面的分子水平機(jī)制研究，仍然缺乏直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)和可靠的研究手段。因此，應(yīng)用顯微技術(shù)，直接監(jiān)測和觀察G-四鏈體結(jié)構(gòu)在細(xì)胞內(nèi)的行為，是闡述其功能分子機(jī)理的重要途徑之一。目前，基于熒光技術(shù)開發(fā)的儀器和技術(shù)，如熒光顯微鏡細(xì)胞成像技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)分析和生物醫(yī)學(xué)研究等各

2、領(lǐng)域。因此利用有特異性的小分子熒光探針，結(jié)合熒光顯微技術(shù)，進(jìn)行實(shí)時(shí)示蹤G-四鏈體結(jié)構(gòu)在細(xì)胞內(nèi)行為是研究其生物功能分子機(jī)理的很好策略。
　　噻唑橙(thiazole orange，TO)是由Lee等人合成的最早用于網(wǎng)織紅血球分析的染料。其結(jié)構(gòu)由苯并噻唑鹽和與喹啉鹽通過次甲基連接而成。該化合物具有很好的細(xì)胞膜滲透性，較高的量子產(chǎn)率，但它與各種DNA(包括雙鏈和四鏈DNA)結(jié)合時(shí)均能產(chǎn)生很強(qiáng)的熒光信號(hào)，選擇性差。苯乙烯取代喹啉衍生物是另

3、一種DNA熒光探針。我們希望通過在噻唑橙的基礎(chǔ)上引入苯乙烯等結(jié)構(gòu)片段，期待改善其選擇性。
　　本論文主要內(nèi)容為:(1)設(shè)計(jì)并合成了一系列苯乙烯取代噻唑橙的衍生物;(2)運(yùn)用熒光光譜研究該類衍生物與G-四鏈體DNA結(jié)合的熒光性能(3)通過CD光譜和FRET實(shí)驗(yàn)研究了衍生物與G-四鏈體結(jié)構(gòu)的互相作用;(4)運(yùn)用分子對(duì)接方法研究了噻唑橙及其衍生物與G-四鏈體DNA結(jié)合模式;(5)應(yīng)用凝膠電泳和細(xì)胞成像等方法證實(shí)衍生物作為G-四鏈體DNA

4、熒光探針的應(yīng)用;(6)通過紫外光譜、熒光光譜、細(xì)胞成像研究了部分衍生物作為RNA熒光探針的應(yīng)用。
　　結(jié)果表明，引入的苯乙烯取代基是能夠顯著提高衍生物對(duì)G-四鏈體DNA的選擇性，并顯示出很強(qiáng)的G-四結(jié)構(gòu)穩(wěn)定能力。計(jì)算機(jī)模擬數(shù)據(jù)顯示苯乙烯取代基的類型對(duì)衍生物與G-四的結(jié)合模式和結(jié)合能力有重要的影響，并進(jìn)一步影響衍生物對(duì)雙鏈DNA和G-四鏈體DNA的選擇性。衍生物的光學(xué)特性，結(jié)合常數(shù)，選擇性、靈敏度、光穩(wěn)定性等系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示該類衍

5、生物是一種優(yōu)秀的熒光探針。在變性PAGE實(shí)驗(yàn)中和活細(xì)胞染色等實(shí)驗(yàn)中的優(yōu)異表現(xiàn)，擴(kuò)充了該類探針在生化及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的可能性。實(shí)驗(yàn)中我們還意外發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的RNA特異性熒光染料4j。該探針同時(shí)擁有經(jīng)典的核酸熒光探針TO和DNA染料C61的結(jié)構(gòu)片段。實(shí)驗(yàn)中4j、已報(bào)道的RNA熒光探針E36和商業(yè)化SYTO RNASelect對(duì)比，并證明了該染料4j能提供更優(yōu)異的核酸特異性、光穩(wěn)定性、低毒性等RNA染料性能。此外，染料被成功地運(yùn)用在核仁RNA的