2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、地雷是一種常見的隱蔽性極高的防御性爆炸火器。早在公元1130年就有地雷使用的相關(guān)記錄。19世紀(jì)中葉以后,烈性炸藥2,4,6-三硝基甲苯的發(fā)現(xiàn),推動了地雷制式化、多樣化的發(fā)展,地雷作為一種廉價、高效的防御武器一直沿用至今。
  地雷的應(yīng)用對現(xiàn)代戰(zhàn)爭產(chǎn)生了巨大的推動作用,地雷以其高隱蔽性和高殺傷性的優(yōu)勢,使其幾乎受到了歷次現(xiàn)代戰(zhàn)爭的青睞,因此如何在戰(zhàn)場上安全、有效地偵測出地雷埋藏位置,是所有交戰(zhàn)雙方必須解決的問題。此外,地雷對有生力量

2、的殺傷作用并不僅僅在戰(zhàn)爭過程中,地雷的長效性和殺傷性并不隨戰(zhàn)爭的結(jié)束而終結(jié),許多地雷在戰(zhàn)場上并未引爆或排除,這些遺留地雷至今仍在威脅著當(dāng)?shù)厝嗣竦纳踩?。因此針對地雷安全、有效的偵測方法一直是各國軍事武器專家廣為研究的課題。
  傳統(tǒng)的地雷檢測方法有生物探測、金屬探測、聲波探測、雷達探測等,這些傳統(tǒng)的探測手段有一定的局限性。生物探測主要基于動物對于氣味的感官反應(yīng),由于動物思想不可控制,探測具有很大的不確定性;金屬、聲波和雷達探測主

3、要基于探測者的主觀判斷,并且大多數(shù)情況下需要身赴雷區(qū),具有很大的危險性,并且無法針對目前出現(xiàn)的陶瓷、塑料等新型材質(zhì)的地雷進行探測。為了解決以上這些問題,基于合成生物學(xué)的地雷檢測方法應(yīng)運而生。該方法可依據(jù)地雷的爆炸填充物為靶標(biāo)化合物進行檢測,規(guī)避了地雷材質(zhì)的問題。利用細(xì)菌進行群體檢測可以有效地避免個體主觀差異對探雷的影響,提高地雷檢測的客觀準(zhǔn)確性,可以與傳統(tǒng)的地雷檢測方法互為補充,進而提高地雷檢測的準(zhǔn)確性和安全性。
  合成生物學(xué)是

4、20世紀(jì)發(fā)展起來的一門基于生命科學(xué)的多學(xué)科交叉新興學(xué)科。目前合成生物學(xué)的研究內(nèi)容主要可以分為以下三個層次:一是對自然界已知功能的生物元件進行標(biāo)準(zhǔn)化設(shè)計,進而形成模塊,根據(jù)工程學(xué)思想,自下而上進行逐級組裝,構(gòu)建出具有全新功能的基因線路或生命系統(tǒng);二是隨著基因合成技術(shù)的發(fā)展,通過人工設(shè)計、合成、組裝新的生命體基因組,實現(xiàn)生命體的重構(gòu);第三個層次建立在前兩個層次的基礎(chǔ)上,創(chuàng)造完整的全新生物系統(tǒng),乃至人工生命體。
  生物傳感器的構(gòu)建系基

5、于合成生物學(xué)研究內(nèi)容的第一層次,通過挖掘自然界中對靶標(biāo)化合物敏感的感應(yīng)元件與適于體現(xiàn)感應(yīng)強度的報告元件進行組裝,通過對報告元件所產(chǎn)生信號的讀取分析,感應(yīng)出靶標(biāo)化合物的濃度、位置等信息。
  本研究擬構(gòu)建的地雷探測生物傳感器也主要由感應(yīng)元件和報告元件構(gòu)成,目前生物傳感器報告元件的發(fā)展已經(jīng)比較成熟,主要有l(wèi)uxCDABE、GFP、lacZ等。研究主要以地雷的常規(guī)爆炸裝填物2,4,6-Trinitrotoluene(TNT)為靶標(biāo)分子,

6、挖掘自然界存在的感應(yīng)元件,并對其進行一系列分析和改造以提高感應(yīng)活性,或通過自然界中已有報道的一些可感應(yīng)TNT的調(diào)控線路,構(gòu)建基因傳感線路,最后圍繞合成生物學(xué)生物傳感器的構(gòu)建,搭建可用于細(xì)菌自裂解的基因模塊,以期實現(xiàn)完整生物傳感器的構(gòu)建。
  研究內(nèi)容主要分為以下幾個方面:
  (1)天然TNT感應(yīng)元件發(fā)掘
  選擇實驗室遺傳操作最為明晰的大腸桿菌入手,進行大腸桿菌的TNT天然感應(yīng)元件挖掘。為了便于啟動子文庫的構(gòu)建與篩選

7、,首先構(gòu)建了一個可用于啟動子篩選的載體pTJH629,向載體中引入了大腸桿菌低拷貝復(fù)制子pSC101 ori。
  通過提取純化E.coli K-12 MG1655基因組,并利用SA U3AI內(nèi)切酶對其完全酶切,以luxCDABE化學(xué)發(fā)光為報告手段構(gòu)建大腸桿菌基因組天然啟動子文庫,經(jīng)過高低濃度TNT的兩輪篩選,在文庫中得到具有一定特異性和靈敏度的5個啟動元件,并對5個啟動元件進行特異性、靈敏度、時效性分析,發(fā)現(xiàn)其具有較好的啟動活性

8、。
  通過對5個元件基因序列的進一步分析,在大腸桿菌基因組中比對得到相應(yīng)位置序列信息,通過數(shù)據(jù)庫比對以及啟動子在線預(yù)測等方法,得到了各個元件序列中可能存在的啟動序列。接著利用體外直接退火擴增的方法,得到這些序列,并針對啟動元件對TNT的敏感性進行研究,以對元件的最小功能序列進行確證,最后確證了其中兩個元件發(fā)揮功能的最小序列topAp4和recEA4。
  (2)基于應(yīng)激損傷機制的人工啟動子文庫構(gòu)建與篩選
  通過上一

9、步中對大腸桿菌基因組中啟動元件的篩選發(fā)現(xiàn),topA和recEA4均屬于細(xì)菌SOS家族成員,同時結(jié)合文獻調(diào)研,發(fā)現(xiàn)細(xì)菌應(yīng)急損傷家族可以受到TNT的誘導(dǎo)反應(yīng)。因此進一步對SOS家族的基因啟動子進行了考察,從中得到了幾個對TNT有明顯誘導(dǎo)反應(yīng)的啟動子。通過對篩選得到的SOS啟動元件進行序列分析,從其中序列共性較多的啟動子(sulA、recA、umuDC)著手,對其序列的保守區(qū)進行提取,對其可變區(qū)進行完全隨機突變,構(gòu)建SOS啟動子的隨機突變文庫

10、。在文庫中對TNT感應(yīng)情況進行考察,從中篩選出了5個可受TNT調(diào)控的全新的SOS啟動子,通過對啟動特性的考察,發(fā)現(xiàn)其在保證特異性、時效性等特性的基礎(chǔ)上其靈敏度較野生型SOS啟動子都有顯著提升。
  (3)惡臭假單胞菌XylR5-Pu-GFP測線路構(gòu)建
  惡臭假單胞菌mt-2能夠以甲苯硝基衍生化合物中的硝基作為氮源進行生理代謝,因此惡臭假單胞菌中肯定存在可受TNT誘導(dǎo)的調(diào)控元件,根據(jù)文獻調(diào)研發(fā)現(xiàn)其發(fā)揮功能的關(guān)鍵元件為TOL質(zhì)

11、粒上的XylR-Pu線路。XylR蛋白作為惡臭假單胞菌甲苯代謝通路中的關(guān)鍵調(diào)控因子,可受甲苯及其衍生化合物的調(diào)控反應(yīng),激活上游的Pu啟動子,根據(jù)此調(diào)控原理,以文獻報道的對2,4-Dinitrotoluene(2,4-DNT)特異的XylR突變體XylR5為調(diào)控因子,以GFP為報告基因,構(gòu)建了XylR-Pu-GFP基因調(diào)控線路。利用重組工程方法將線路整合到假單胞菌基因組上,并通過Cre-loxP實現(xiàn)了構(gòu)建過程中抗性基因的敲除,實現(xiàn)了生物傳

12、感器基因工程菌的菌株構(gòu)建。同時搭建了一個質(zhì)粒平臺pSN129,可通過對平臺上的元件進行替換,實現(xiàn)線路功能的轉(zhuǎn)換。
  (4)可受阿拉伯糖誘導(dǎo)的細(xì)菌自裂解模塊構(gòu)建
  為了實現(xiàn)基因工程菌對環(huán)境的無污染、無殘留,本研究還開展了對生物傳感器的檢測后自毀模式的研究。通過文獻調(diào)研發(fā)現(xiàn)了T4噬菌體的穿孔素蛋白Holin與T4溶菌酶的配合使用可調(diào)控實現(xiàn)細(xì)菌自殺,以此為基礎(chǔ)設(shè)計構(gòu)建了pBAD-Holin-Lysozyme-AntiHolin

13、的自殺線路,通過引入Holin拮抗蛋白AntiHolin的表達,實現(xiàn)了含有自殺表達模塊的菌株的正常生長,同時通過替換AntiHolin的啟動子,實現(xiàn)其不同強度的表達,也可使自殺的起效時間、自殺強度高低得到一定控制。
  綜上所述,在本研究中以大腸桿菌基因組為模板,構(gòu)建了基因組天然啟動子文庫,從中篩選得到了5個可受TNT誘導(dǎo)的天然啟動子元件,其啟動活性均達到或超過了國際上報道的元件的領(lǐng)先水平;結(jié)合篩選結(jié)果與文獻調(diào)研,通過對大腸桿菌S

14、OS應(yīng)激損傷系統(tǒng)的啟動子篩查,得到了幾個可受TNT調(diào)控的SOS啟動子,通過對其進行序列分析,設(shè)計了一個SOS啟動子的隨機突變文庫,并在文庫中篩選得到了5個全新的SOS啟動元件,并且其靈敏度較同類元件有顯著提高;通過對假單胞菌天然元件XylR-Pu的應(yīng)用,構(gòu)建了XylR5-Pu-GFP基因工程菌,并實現(xiàn)了基因組引入抗性的剔除,并且構(gòu)建了一個基因線路平臺pSN129,可便捷的替換元件改變功能;通過對T4噬菌體Holin蛋白與穿孔素蛋白作用原

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