2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、細(xì)胞微生物學(xué)研究方法,前言,人們僅確知一小部分細(xì)菌可導(dǎo)致人類疾病。這些細(xì)菌一般可分為兩類:致病菌和條件致病菌。醫(yī)療手段不斷提高,抗生素的研制也在不斷發(fā)展,但由各種病原體所導(dǎo)致的疾病仍有很高的發(fā)病率和致死率 。越來越多耐藥性病原體的出現(xiàn)可能使我們很快進入一個“后抗生素期” 。更好地理解病原體的毒力機制和疾病中病原—宿主相互作用可為治療疾病確立新的靶。我們應(yīng)該發(fā)展更多的新的分子生物學(xué)技術(shù)來研究細(xì)菌的各個組分,確定細(xì)菌的毒力因子。,Ko

2、ch’s Postulates,1890年, Koch: 要想確定一種疾病是由于某種微生物的感染所引起,必須滿足4項條件:一、每一例病人體內(nèi)都可以分離到該病菌。二、該病菌可以在體外培養(yǎng)數(shù)代。三、培養(yǎng)了數(shù)代的細(xì)菌可以使實驗動物引發(fā)同樣的疾病。四、被接種的動物中可以分離到同樣的病菌。,Molecular Koch‘s postulates,基因可以在有確定毒力表型的菌株中發(fā)現(xiàn);基因突變后表型喪失;再導(dǎo)入該基因?qū)⒃谕蛔冎曛兄亟ㄔ摫?/p>

3、型。,Stanley Falkow. Molecular Koch‘s postulates applied to microbial pathogenicity. Rev Infect Dis. 1988. 10 S2:S274-6,常用的體外微生物實驗技術(shù)常用的體內(nèi)微生物實驗技術(shù),DNA 突變重組差異表達研究技術(shù)Microarray 基因芯片,常用的體外微生物實驗技術(shù),突變分析,突變(Mutation):細(xì)菌的基因結(jié)構(gòu)發(fā)生偶然

4、的改變。 細(xì)菌的自然突變率與其生物的自然突變相同,每106~108次細(xì)胞分裂發(fā)生一次。細(xì)菌每20~30分鐘分裂一代,故突變株相對較多。 細(xì)菌中點突變較多見。當(dāng)突變發(fā)生在DNA一對或少數(shù)幾對堿基引起改變時,稱為點突變。,突變分析,1. 定向突變 (directed mutation) 是用于評價特異細(xì)菌基因產(chǎn)物毒力分布的最廣泛技術(shù)。在一種稱為“反向遺傳學(xué)”的技術(shù)中,編碼假定毒力因子的基因被插入滅活或基因替代所破壞,然

5、后比較同源突變株與親代株的毒力。這一技術(shù)需要將DNA介導(dǎo)入病原體內(nèi),還需要合適的選擇性標(biāo)記以及同源重組的天然能力。,在定向突變中,抗生素耐受標(biāo)記或其他選擇性標(biāo)記連于靶基因克隆復(fù)制物的編碼序列內(nèi),這就破壞了基因的正常轉(zhuǎn)錄和翻譯,并為選擇重組子提供了標(biāo)記。接著,重組子被介導(dǎo)入靶病原體,并與細(xì)菌染色體的同源區(qū)進行重組。如果耐受標(biāo)記兩側(cè)是染色體特異序列,就會發(fā)生雙重交叉(double crossover),標(biāo)記基因整合入染色體序列,而載體序列不

6、整合 。,定向突變,蔗糖敏感標(biāo)記在H.pylori vacA基因中導(dǎo)入突變的方法,PCR:H.pylori flaA啟動子區(qū)、無啟動子的sacB基因, 卡那霉素耐受基因(kan),構(gòu)建kan-sacB cassette,插入pEK,得到pEnKSF,1.95kb的vacA基因(EcoRⅠ-KpnⅠ)克隆入pBluescript KS載體,構(gòu)建pEK,與細(xì)菌染色體的同源區(qū)進行雙交換重組,突變的VacA菌株,定向突變,隨機突變,傳統(tǒng)的方法使

7、用UV或化學(xué)試劑在細(xì)菌基因組內(nèi)造成核苷酸的改變,導(dǎo)致基因表達的變化 。缺點:沒有合適的方法來篩選減毒株和突變的基因細(xì)菌轉(zhuǎn)座子(transposon)轉(zhuǎn)座子是存在于染色體DNA上可自主復(fù)制和位移的基本單位,常通過產(chǎn)生插入突變影響基因的調(diào)控與表達,導(dǎo)致細(xì)菌生物學(xué)性狀或毒力等的改變。轉(zhuǎn)座子誘變技術(shù)已被廣泛用于細(xì)菌分子遺傳學(xué)研究,包括3個步驟:將轉(zhuǎn)座子插入靶基因;篩選感興趣的突變體,并證實該突變是由轉(zhuǎn)座子插入引起的;確定并克隆靶基因。

8、 優(yōu)點:不需要鑒定待測基因的產(chǎn)物,只要轉(zhuǎn)座基因插入可引起表型發(fā)生變化的基因均可用此法分離鑒定。,二、差異表達研究,分離微生物差異表達基因mRNA 差異顯示技術(shù)差減雜交和抑制差減雜交cDNA代表性差異分析基因鑒定集成法,二、差異表達研究,1. mRNA 差異顯示技術(shù)DD-PCR mRNA differential display reverse transcription PCR 是建立在基因差別表達的基礎(chǔ)上,

9、通過比較不同的個體之間mRNA的差異,應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)而發(fā)展起來的一種分離未知基因的方法。 缺點:重復(fù)性差、假陽性高、差異片段短小等。,2、差減雜交和抑制差減雜交,差減雜交(subtractive hybridization,SH) Straus等于1990年首次用于微生物研究:野生株酵母與變異株酵母進行消減雜交。抑制差減雜交 (suppression subtractive hybridization, SS

10、H) 1996年Diatchenko在SH基礎(chǔ)上進一步改善。,差減雜交的原理:,提取待比較的兩種基因組DNA,待于尋找差異DNA的稱為實驗株(tester),,另一方作參考,稱為驅(qū)動株(driver),,,在雜交前連接接頭和tester DNA,并用生物素標(biāo)記driver DNA 。,保證tester DNA序列較短,雜交,雜交后,含有driver DNA的雜合子可通過鏈親和素的吸附作用而移去,接頭序列為引物,用PCR擴增剩余的

11、序列,也就是僅存在于tester DNA中的序列,重復(fù)一次,將PCR序列克隆入載體中,產(chǎn)生差減文庫,抑制差減雜交技術(shù)(SSH),將tester DNA分為兩部分,各自在5’端接上不同的接頭,,driver DNA雜交的序列應(yīng)均被清除,只留下tester 特異的單鏈序列,用與接頭序列結(jié)合的引物進行PCR擴增 * 抑制效應(yīng):兩端含有相同接頭的序列由于形成二級結(jié)構(gòu)阻止了引物的退火,只有兩端含有不同接頭的e分子得以擴增。,單鏈 teste

12、r DNA,雙鏈tester DNA,tester DNA和driver DNA形成的異源雙鏈分子,driver DNA單鏈及自身退火的雙鏈分子,第二輪雜交。將兩份雜交產(chǎn)物混合并進行第二次雜交,產(chǎn)生第5種新的雙鏈分子e,它的兩個5’端連有兩個不同的接頭,兩條鏈均為tester DNA特異鏈,將PCR序列克隆入載體中,產(chǎn)生差減文庫,SH在微生物研究中的應(yīng)用,檢測毒力島,尋找毒力有關(guān)基因。檢測不同菌株表達的不同;同一株菌在不同條件下表達的

13、不同。 檢測有毒株與無毒株的基因差異,研究毒力的改變?nèi)琊じ叫?、侵襲性。2000年用SH方法檢測有毒株TB和無毒株TB表達的不同,或高表達的基因。發(fā)現(xiàn)了devR和devS與毒力有關(guān)。 B組鏈球菌主要分為III-1,2,3株,其中III-3最易感染新生兒,說明毒力最強,用SH將它與III-2、1進行雜交,發(fā)現(xiàn)9個短特異序列,可能與毒力有關(guān)。,SH技術(shù)的缺陷,表達量很低的差異mRNA也很難被擴增。所以一些量

14、少的基因不作為SH的檢測對象,如轉(zhuǎn)錄因子,細(xì)胞因子,受體等。要檢測出表達量的不同要高于5倍才行。一些重要的差異基因可能會漏過。SH主要檢測在G+C%豐富的菌中G+C%含量低的區(qū)域。SH無法將兩個菌的不同基因都測出,得到的產(chǎn)物不全是差異基因。要考慮用其他技術(shù)補充。,3、cDNA代表性差異分析 cDNA RDAcDNA Representation difference analysis,綜合了差減雜交和差別顯示兩項技術(shù)的優(yōu)點,

15、并充分利用PCR反應(yīng)的特性,達到特異性擴增目的基因的目的。 原理:每次對兩個cDNA 代表群進行差減雜交前都更換特定的接頭和引物,利用PCR以指數(shù)形式擴增雙鏈模板(帶有特定接頭的tester DNA),而僅以線性形式擴增單鏈模板這一特性,從而使得只有差異表達的基因片段得到高度富集。,cDNA RDA,4、基因鑒定集成法( IPGI) cDNA Representation difference analysis,是對以往各種相

16、關(guān)技術(shù)的一種有效的綜合。在目前表達序列標(biāo)簽( Expressed Sequence Tags , ESTs) 計劃發(fā)展的基礎(chǔ)上,總結(jié)了現(xiàn)有的各種基因差別表達分析技術(shù)的優(yōu)缺點,將 DD-PCR、SSH、SAGE和基因數(shù)據(jù)庫技術(shù)進行了有機結(jié)合。 特點:tester有兩種不同的接頭,在差減雜交中只有代表稀有拷貝基因且兩端帶不同接頭的cDNA 片段才能以指數(shù)擴增,使得目的序列得以高度富集;只回收3’ cDNA,從而最大限度地利用ESTs

17、數(shù)據(jù)庫。,三、基因芯片,基因芯片是指通過微加工技術(shù)將大量的DNA以預(yù)先設(shè)計的排列方式有序地固定在載體表面,形成儲存有大量信息的DNA陣列。檢測時,首先用不同條件下培養(yǎng)的細(xì)菌的RNA為模板,以放射性同位素或熒光標(biāo)記的dNTP為底物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。再用所得cDNA與DNA芯片進行雜交,然后通過計算機對結(jié)果進行判讀和處理,這樣就可以找到條件變化時基因表達的情況。,基因芯片應(yīng)用,微生物比較基因組學(xué)研究微生物基因表達譜研究微生物檢測鑒定研

18、究,Microarray 特點,規(guī)?;瘷z測PCR基礎(chǔ)的microarray 不能檢測到點突變和嵌合基因存在一定假陽性率和假陰性率,需用其他方式驗證,,問號鉤體基因組DNA芯片的組成,鉤體賴株在GenBank中共注釋了4727個基因,鉤體DNA芯片上共包含了3528個ORFs,每個ORF在芯片上有三個重復(fù)。每張芯片還包含了相應(yīng)的陽性對照點(鉤端螺旋體代謝相關(guān)基因)及陰性對照點(棉花和人的基因)。,STMIVETDFIIVE

19、ATGAMBIT,常用的體內(nèi)微生物實驗技術(shù),體內(nèi)誘導(dǎo)基因 in vivo-induced gen,ivi gene,僅在微生物進入宿主體內(nèi)后才被誘導(dǎo)表達在體外生長時不表達的獨特基因。往往能增強其在宿主體內(nèi)的生存能力,致病性甚至決定著細(xì)菌毒力強弱,極有可能是病原菌在宿主體內(nèi)生長、繁殖及致病的關(guān)鍵基因,也是潛在的抗生素作用靶點、診斷抗原以及疫苗候選者,具有重要的研究價值。隨著分子生物學(xué)技術(shù)及分子遺傳學(xué)研究手段的發(fā)展,依賴動物模型

20、的IVET、DFI、STM 以及不依賴感染動物模型的IVIAT 等研究方法的發(fā)明及成功運用使得針對微生物 ivi gene 的研究成為可能。,是一種基于轉(zhuǎn)座子的突變技術(shù)。是由Holden 及其同事于1995 年在研究傷寒鼠沙門氏菌時建立起來的,用來鑒定能使病原體在宿主體內(nèi)成功存活和繁殖的決定性基因。在病原體的基因組中隨機插入特異性信號標(biāo)簽,與病原體致病有關(guān)的毒力基因中由于插入轉(zhuǎn)座子而失活,無法在宿主體內(nèi)生存、繁殖。通過突變體庫感染宿

21、主,然后對未存活的突變體進行負(fù)篩選就可篩選出毒力基因失活的突變體菌株。,信號標(biāo)簽誘變(STM) Signature-tagged mutagenesis,STM技術(shù)tags的構(gòu)建:可變區(qū)40bp,由4個堿基隨機排列而成,理論上可形成1012種不同DNA片段。,,STM 的特點,通過聯(lián)合轉(zhuǎn)座子插入誘變技術(shù)和體內(nèi)負(fù)篩選原則使篩選策略由原來針對單個突變株的逐一鑒定轉(zhuǎn)變?yōu)獒槍?fù)雜突變體群的系統(tǒng)篩選,篩選過程更為快捷與系統(tǒng);特異性DNA 序列

22、對突變體的逐一標(biāo)記也能輕易地鑒定出被突變的基因,將工作量和實驗動物用量降到最低。,STM 的局限性,一是插入性誘變實驗存在的共同局限性,如插入事件存在隨機性,使得某些較小基因片段(<400 bps)的插入性轉(zhuǎn)座誘變較難實現(xiàn);某些基因區(qū)域本身為體內(nèi)轉(zhuǎn)座或重組的熱區(qū)或冷區(qū)也影響著轉(zhuǎn)座誘變作用的成功率;需要建立能方便地從其感染器官組織中回收尚且存活的細(xì)菌突變株的合適動物模型等。 另一方面的局限性則為STM 技術(shù)所特有,包括:標(biāo)簽信號衰

23、減的影響;眾多突變體株同時收集并實驗可能導(dǎo)致其中某些單一信號的削弱,從而影響結(jié)果可靠性;另外,由于多個突變株同時存在并共同作用,突變株之間的缺陷代償可能導(dǎo)致某些突變基因不能被篩選與鑒定,出現(xiàn)假陰性結(jié)果等。,體內(nèi)表達技術(shù)In vivo expression technology,IVET,利用病原基因組隨機片段與缺乏啟動子的報告基因構(gòu)建融合載體(啟動子誘捕文庫),在動物體內(nèi)重組到細(xì)菌基因組中而使報告基因表達,篩選病原菌感染過程中表達基因

24、的方法。 采用常規(guī)的分子生物學(xué)技術(shù)即能進行篩選,不需要昂貴的儀器設(shè)備,優(yōu)勢明顯;不需要對目標(biāo)病原菌的基因組特性進行深入詳細(xì)的認(rèn)識即可對細(xì)菌在宿主環(huán)境條件下的基因表達情況進行分析研究。,Example: 鼠傷寒沙門菌purA缺陷型模型purA基因作為可選擇的報告基因;lacZ基因(編碼β-半乳糖苷酶)供體外選擇。,差異熒光誘導(dǎo)(DFI),以GFP為報告基因來監(jiān)測啟動子活性。 將GFP 編碼基因置于目標(biāo)病原菌啟動子文

25、庫的下游,采用熒光激活細(xì)胞分選術(shù)對包含有啟動子-GFP融合活性的菌落與不能表達GFP 的菌落進行分離,通過對體內(nèi)及體外環(huán)境中熒光細(xì)胞的連續(xù)分離與比較以確定僅在體內(nèi)環(huán)境中存在的細(xì)胞及相應(yīng)的突變基因。,gfp基因 編碼一種水母蛋白-綠色熒光蛋白(GFP),在受到藍(lán)光激發(fā)后會發(fā)出綠色熒光。GFP的一個重要特征是它的熒光信號能通過FACS來檢測,這意味著含有與gfp基因融合的啟動子庫的細(xì)菌可自動篩選出活化的啟動子,這樣成千上萬的啟動

26、子可在數(shù)分鐘內(nèi)被分離。FACS還能分選表達GFP的細(xì)菌粘附或內(nèi)在化的真核細(xì)胞,使檢測由于和宿主細(xì)胞相互作用而激活的細(xì)菌基因成為可能。,將熒光激活細(xì)胞分選術(shù)和基因組學(xué)研究進行整合,對微生物基因表達情況進行高通量的半自動篩選,操作簡單、迅速、實驗重復(fù)性高;具有熒光性質(zhì)穩(wěn)定,無細(xì)胞毒性,不干擾細(xì)菌在宿主體內(nèi)的侵襲、擴散和增值過程,可直接用于活細(xì)胞測定等優(yōu)點。GFP 的運用使研究者能對基因的表達情況及單細(xì)胞水平的啟動子活性進行客觀觀察與分析

27、,并可通過簡單改變熒光閾值來調(diào)節(jié)選擇敏感性。,DFI的特性,不能檢測需要轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的基因;需要構(gòu)建和分析目標(biāo)基因突變株以評估靶基因在天然感染中的作用;細(xì)菌的聚集與粘附可能影響流式細(xì)胞分類與檢測分析;研究環(huán)境的pH 變化、氧氣供給情況以及缺乏信號放大效應(yīng)等也會影響GFP 的使用;由于熒光為非線性信號,每次實驗時都需要對信號的線性范圍進行檢測和校準(zhǔn)以確保準(zhǔn)確量化基因的表達情況;采用細(xì)胞模型,不適用于動物模型的篩選,因此篩選結(jié)果不夠

28、全面,不能反映致病菌感染的全部環(huán)節(jié)。,DFI的缺陷,體內(nèi)誘導(dǎo)抗原技術(shù) IVIAT (in vivo induced antigen technology),直接從“蛋白”角度入手篩選毒力基因 Handfield及其合作者于2000年在研究口腔病原菌時設(shè)計提出,通過對表達文庫進行免疫篩選得到病原菌的體內(nèi)誘生基因。 作為一種簡單有效的篩選技術(shù),IVIAT 已被成功用于多種病原微生物ivi gene 的研究中,如豬鏈球菌、炭疽桿菌、傷

29、寒沙門氏菌以及白色念珠菌等等。,體內(nèi)誘導(dǎo)的抗原技術(shù),取感染過所研究病原體的多個病人的血清,用體外生長的該病原細(xì)胞將相應(yīng)抗體全部吸收,只留下僅在體內(nèi)表達的抗原的相應(yīng)抗體。,在合適的宿主中建立該抗原DNA的表達庫,用吸收后血清探測這些克隆,有反應(yīng)的克隆即產(chǎn)生自然感染而非體外培養(yǎng)過程中表達的抗原,通過純化、測序,即可鑒定體內(nèi)誘導(dǎo)的抗原基因。,將這些抗原純化,用于證實IVI抗原確由病原體在感染過程中表達。,IVIAT的特點,IVIAT不依賴于動

30、物模型,而是以急性感染患者的恢復(fù)期血清為探針篩選病原菌的 ivi gene,應(yīng)用范圍廣泛,可真實全面地反映病原菌與人類感染宿主之間的相互作用。 僅使用簡單的免疫學(xué)和常規(guī)基因組克隆技術(shù)即可快速及時對病原菌基因組進行系統(tǒng)篩選,不需要對目的病原菌基本遺傳學(xué)背景進行詳細(xì)了解,尤其適用于一些新現(xiàn)病原菌的致病性研究。 所需生物學(xué)材料極少,僅需采集受染患者的恢復(fù)期血清或少量含有病原菌的受染組織或體液成分即可進行,血清庫的建立使研究人員可以最大程度

31、獲得病原菌不同途徑感染和感染不同階段的抗原。,IVIAT的缺陷,僅適用于可培養(yǎng)病原微生物;具抗體反應(yīng)依賴性;對于一些不具免疫原性或某些細(xì)菌在體內(nèi)體外生存都必需的毒力基因表達產(chǎn)物不能很好鑒別;不能自動化操作;會受到免疫交叉反應(yīng)的影響而造成假陽性,因此IVIAT 的陽性菌落需要經(jīng)過多次重復(fù)篩選,還需用陰性感染血清為對照以確保免疫反應(yīng)的特異性。,4種細(xì)菌毒力基因篩選技術(shù)方法的比較,體外轉(zhuǎn)座進行基因組分析和作圖 GAMBIT Ge

32、nomic Analysis and Mapping by In Vitro Transposition,鑒定基因組已經(jīng)被測序的微生物中對于病原菌的生長(體內(nèi)/體外)是必需的基本基因。,a. Strategy for producing chromosomal mutations by using in vitro transposon mutagenesis.,A specific region of the ch

33、romosome is amplified by extended- length PCR, and subjected to in vitro transposon mutagenesis. The resultant pool of mutagenized DNA is then transformed into bacteria, which are then grown under selective conditions

34、(e.g. on defined medium or in an animal). PCR is then performed on the post selection pool using a transposon-specific primer and a primer to a known location on the chromosome. Subsequent analysis of the PCR products

35、allows determination of which genes in that region of the chromosome are required for survival under those selective conditions.,b. Genetic footprinting for detection of essential genes.,GAMBIT提供了一種有力的手段在那些比體外豐富培養(yǎng)基環(huán)境要嚴(yán)格得

36、多的環(huán)境下鑒定病原生長或生存的必須基因,目前已經(jīng)被成功運用于鑒定流感嗜血桿菌、釀酒酵母、肺炎鏈球菌等病原的基本基因。 GAMBIT雖然是應(yīng)用在基因組水平的分析,它仍然可以針對某段感興趣的特別的特定DNA元件或染色體區(qū)域進行操作,例如噬菌體和毒力島等。,GAMBIT的特點,噬菌體展示技術(shù) (phage display techniques,PDT),噬菌體(Bacteriophage):是感染細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒的

37、總稱,部分能引起宿主菌的裂解,具有基因和結(jié)構(gòu)單一性的特點。PDT是一種將外源肽或蛋白質(zhì)與特定噬菌體衣殼蛋白融合并展示于噬菌體表面的技術(shù)。它將外源基因插入到噬菌體展示載體的信號肽基因和衣殼蛋白編碼基因之間,從而使外源基因編碼的多肽或蛋白質(zhì)與外殼蛋白以融合蛋白質(zhì)形式展示在噬菌體表面,被展示的外源肽或蛋白質(zhì)可保持相對獨立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性,以利于靶分子的識別和結(jié)合。 探測蛋白空間結(jié)構(gòu)、探索受體與配體之間相互作用結(jié)合位點、確定抗原表位、尋

38、找高親和力和生物活性的配體分子。,PDT原理,主要包括三方面內(nèi)容:通過 DNA 重組的方法插入外源基因,形成的融合蛋白表達在噬菌體顆粒的表面,同時保持外源蛋白的天然構(gòu)象,不影響噬菌體的生活周期,也能被相應(yīng)的抗體或受體所識別;篩選目的噬菌體,利用固定于固相支持物的靶分子,采用適當(dāng)?shù)奶韵捶椒?,洗去非特異結(jié)合的噬菌體,篩選出融合噬菌體;外源多肽或蛋白質(zhì)表達在噬菌體的表面,而其編碼基因作為病毒基因組中的一部分可通過分泌型噬菌體的單鏈 DN

39、A測序推導(dǎo)出來。,PDT,PDT局限性,在噬菌體展示過程中必須經(jīng)過細(xì)菌轉(zhuǎn)化、噬菌體包裝,有的展示系統(tǒng)還要經(jīng)過跨膜分泌過程,大大限制了所建庫的容量和分子多樣性。不是所有的序列都能在噬菌體中獲得很好的表達,因為有些蛋白質(zhì)功能的實現(xiàn)需要折疊、轉(zhuǎn)運、膜插入和絡(luò)合,導(dǎo)致在體內(nèi)篩選時需外加選擇壓力。噬菌體展示文庫一旦建成,很難再進行有效的體外突變和重組,進而限制了文庫中分子遺傳的多樣性。由于噬菌體展示系統(tǒng)依賴于細(xì)胞內(nèi)基因的表達,所以,一些對細(xì)

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