微生物學(xué)課件

1、第7章 微生物的遺傳 變異和育種,遺傳：,親代與子代相似,變異：,親代與子代、子代間不同個(gè)體不完全相同,遺傳（inheritance）和變異（variation）是生命的最本質(zhì)特性之一,遺傳型：,表型（表現(xiàn)型）：,生物的全部遺傳因子及基因,具有一定遺傳型的個(gè)體，在特定環(huán)境條件下通過(guò)生長(zhǎng)發(fā)育所表現(xiàn)出來(lái)的形態(tài)等生物學(xué)特征的總和。,表型是由遺傳型所決定，但也和環(huán)境有關(guān)。,表型飾變：,表型的差異只與環(huán)境有關(guān)特點(diǎn)：暫

2、時(shí)性、不可遺傳性、表現(xiàn)為全部個(gè)體的行為,遺傳型變異（基因變異、基因突變）：,遺傳物質(zhì)改變，導(dǎo)致表型改變特點(diǎn)：遺傳性、群體中極少數(shù)個(gè)體的行為 （自發(fā)突變頻率通常為10-6-10-9）,微生物是遺傳學(xué)研究中的明星：,微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，營(yíng)養(yǎng)體一般為單倍體，方便建立純系。,很多常見(jiàn)微生物都易于人工培養(yǎng)，快速、大量生長(zhǎng)繁殖。,對(duì)環(huán)境因素的作用敏感，易于獲得各類(lèi)突變株，操作性強(qiáng)。,第一節(jié) 遺傳的物

3、質(zhì)基礎(chǔ),一、DNA作為遺傳物質(zhì),二、RNA作為遺傳物質(zhì),三、朊病毒的發(fā)現(xiàn)與思考,一、DNA作為遺傳物質(zhì),第一節(jié) 遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ),Avery在四十年代以更精密的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)重復(fù)了以上實(shí)驗(yàn),分別用降解DNA、RNA、蛋白質(zhì)的酶作用于有毒的S型菌細(xì)胞抽提物,,只有DNA被酶降解破壞的抽提物無(wú)轉(zhuǎn)化活性,,DNA是轉(zhuǎn)化所必需的轉(zhuǎn)化因子,第一節(jié) 遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ),（參見(jiàn) P195）,T2噬菌體感染實(shí)驗(yàn)（1952年）,第一節(jié) 遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ),（參見(jiàn)

4、 P195）,二、RNA作為遺傳物質(zhì),,生化提取分別獲得含RNA的煙草花葉病毒蛋白質(zhì)外殼（病毒1）和核酸（病毒2）,,抗血清處理，證明雜種病毒的蛋白質(zhì)外殼來(lái)自病毒1，而非病毒2,,雜種病毒的后代的蛋白質(zhì)外殼表現(xiàn)為病毒2，而非病毒1,,遺傳物質(zhì)是核酸（RNA）而非蛋白質(zhì),第一節(jié) 遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ),三、朊病毒的發(fā)現(xiàn)與思考,（參見(jiàn) P191 和 P195）,亞病毒的一種：具有傳染性的蛋白質(zhì)致病因子，迄今為止尚為

5、 發(fā)現(xiàn)該蛋白內(nèi)含有核酸。,其致病作用是由于動(dòng)物體內(nèi)正常的蛋白質(zhì)PrP c改變折疊狀態(tài)為PrP sc所致，而這二種蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)并沒(méi)有改變。,人的庫(kù)魯病(kuru)、克雅氏病(Creutzfeldt Jakob disease, CJD)等,羊搔癢癥(scrapie),牛海綿狀腦病(spongiform encephalopathy),引起人與動(dòng)物的致死性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病,Prusiner (1982)

6、提出羊搔癢病因子是一種蛋白質(zhì)侵染顆粒（proteinaceous infectious particle），并將之稱(chēng)做Prion或Virino。 -------朊病毒,1997年，Stanley B. Prusiner榮獲諾貝爾獎(jiǎng),第一節(jié) 遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ),三、朊病毒的發(fā)現(xiàn)與思考,1）蛋白質(zhì)是否可以作為遺傳物質(zhì)？ prion

7、是生命的一個(gè)特例？還是僅僅為表達(dá)調(diào)控的一種形式？,2）蛋白質(zhì)折疊與功能的關(guān)系，是否存在折疊密碼？,DNA→RNA→肽鏈→蛋白質(zhì),核 苷 酸 水 平,,密 碼 子 水 平,,基 因 水 平,遺傳物質(zhì)存在的部位,,核 酸 水 平,,染色體水平,,細(xì)胞核水平,,細(xì)胞水平,,,,核苷酸水平,,核糖核酸和脫氧核糖核酸,,,基因水平,基因是生物體內(nèi)具有自主復(fù)制能力的最小遺傳功能單位，其物質(zhì)基礎(chǔ)是一條以直線排列、

8、具有特定核苷酸序列的核酸片段。基因組是指存在于細(xì)胞或病毒中的所有基因。由于現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)許多非編碼序列具有重要的功能，因此目前基因組的含義實(shí)際上是指細(xì)胞中基因以及非基因的DNA序列組成的總稱(chēng)，包括編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因、調(diào)控序列以及目前功能還尚不清楚的DNA序列。,,原核生物基因的組成,,操縱子,調(diào)節(jié)基因,,結(jié)構(gòu)基因,操作基因,啟動(dòng)基因,原核生物基因的特點(diǎn),遺傳信息的連續(xù)性 功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因組成操縱子結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)基因的單拷貝及rRNA基因的

9、多拷貝基因組的重復(fù)序列少而短,真核生物的基因的特點(diǎn),基因的不連續(xù)性：內(nèi)含子、外顯子。高度拷貝和重復(fù)順序 ：遺傳豐余 。轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯在細(xì)胞中有空間分隔 。,,原核生物的質(zhì)粒,質(zhì)粒的概念：游離于原核生物基因組以外，具有獨(dú)立復(fù)制能力的小型共價(jià)閉合環(huán)狀的dsDNA分子，即cccDNA。質(zhì)粒賦予細(xì)菌某些對(duì)其生存并非必不可少的特殊功能。如：產(chǎn)毒、抗藥、產(chǎn)特殊酶、降解有毒化合物等,質(zhì)粒的主要類(lèi)型,,高拷貝數(shù)(high copy number

10、)質(zhì)粒（每個(gè)宿主細(xì)胞中可以有10-100個(gè)拷貝） ———————松弛型質(zhì)粒,低拷貝數(shù)(low copy number)質(zhì)粒（每個(gè)宿主細(xì)胞中只有1-2個(gè)拷貝） ———————嚴(yán)緊型質(zhì)粒,,窄宿主范圍質(zhì)粒(narrow host range plasmid)（只能在一種特定的宿主細(xì)胞中復(fù)制）,,廣宿主范圍質(zhì)粒(broad host range plasmid)

11、（可以在許多種細(xì)菌中復(fù)制）,典型質(zhì)粒簡(jiǎn)介,F質(zhì)粒：大腸桿菌等部分細(xì)菌內(nèi)存在，決定其性別并具有轉(zhuǎn)移能力的質(zhì)粒。R質(zhì)粒：表現(xiàn)為對(duì)抗生素等藥物的抗性。Col質(zhì)粒：細(xì)菌素的概念,在醫(yī)療中具有危害，但可用于微生物篩選和基因工程的標(biāo)記,部分細(xì)菌由質(zhì)粒編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)生的能抑制或殺死其他近源細(xì)菌的代謝產(chǎn)物。,用于“殘害手足”,Ti質(zhì)粒：,誘癌質(zhì)粒，導(dǎo)致植物產(chǎn)生根癌，膨大等現(xiàn)象；用于植物基因工程。,月季根癌,Ri質(zhì)粒：,發(fā)根質(zhì)粒，誘發(fā)大量稱(chēng)為

12、毛狀根的不定根。,降解性質(zhì)粒：,,僅在假單胞菌（Pseudomonas）中發(fā)現(xiàn)。具有降解復(fù)雜有毒化合物的能力。“超級(jí)菌”。,,隱秘質(zhì)粒（cryptic plasmid）,隱秘質(zhì)粒不顯示任何表型效應(yīng)，它們的存在只有通過(guò)物理的方法，例如用凝膠電泳檢測(cè)細(xì)胞抽提液等方法才能發(fā)現(xiàn)。,它們存在的生物學(xué)意義，目前幾乎不了解。,在應(yīng)用上，很多隱秘質(zhì)粒被加以改造作為基因工程的載體（一般加上抗性基因）,第二節(jié) 基因突變和誘變育種,基因突變,,突變類(lèi)型,

13、突變率,基因突變的特點(diǎn),基因突變自發(fā)性和不對(duì)應(yīng)性的實(shí)驗(yàn)證明,基因突變及機(jī)制,紫外線對(duì)DNA的損傷及其修復(fù),基因突變（gene mutation）,基因突變的概念：,泛指遺傳物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)或數(shù)量突然發(fā)生的可遺傳的變化，可自發(fā)或誘導(dǎo)產(chǎn)生。,野生型菌株（wild type strain）：,從自然界分離到的菌株。,突變株（mutant）：,野生型經(jīng)突變后形成的帶有新性狀的菌株。,基因突變的類(lèi)型,突變株的表型,選擇性突變株,（selectabl

14、e mutant）,,非選擇性突變株,（ non－selectable mutant ）,,營(yíng)養(yǎng)缺陷型,抗性突變型,條件致死突變型,,形態(tài)突變型,抗原突變型,產(chǎn)量突變型,突變率（mutation rate）,細(xì)胞在每一世代中發(fā)生某一性狀突變的幾率。某一基因的突變一般是獨(dú)立發(fā)生的，他的突變率不影響其他基因的突變。通常突變發(fā)生的幾率為10-6～10-9,基因突變的特點(diǎn),1.自發(fā)性。,2.不對(duì)應(yīng)性,細(xì)胞可自發(fā)的產(chǎn)生突變,突變性狀與引起

15、突變的原因間無(wú)直接對(duì)應(yīng)關(guān)系,3.稀有性,突變幾率為10-6～10-9,4.獨(dú)立性,5.可誘變性,誘變劑的使用可大大提高突變幾率,6.穩(wěn)定性,7.可逆性,正向突變/回復(fù)突變,基因突變自發(fā)性和不對(duì)應(yīng)性的證明,1.Luria等的變量實(shí)驗(yàn)（fluctuation test）2.Newcomb的涂布實(shí)驗(yàn)3.Lederberg等的影印平板法（replica plating）,變量實(shí)驗(yàn)（fluctuation analysis）Salvador

16、 Luria and Max Delbruck（1943）,Salvador Luria,Max Delbruck,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1969,Newcombe的涂布實(shí)驗(yàn)（1949）,影印實(shí)驗(yàn)（replica plating ）Joshua Lederberg and Esther Lederberg（1952）,Joshua Lederberg,J. Lederberg

17、 is awarded the Noble Prize in Medicine and Physiology in 1958,突變真的與選擇壓力無(wú)關(guān)嗎？,適應(yīng)性突變（adaptive mutability）和高頻突變（hypermutation ）,Benson S.Adaptive mutation: a general phenomenon or special case?Bioessays. 1997 Jan;19(1):9

18、-11. Review.Galitski T, Roth JR. A search for a general phenomenon of adaptive mutability.Genetics. 1996 Jun;143(2):645-59.Dan I. Andersson, E. Susan Slechta, and John R. Roth Evidence That Gene Amplification Unde

19、rlies Adaptive Mutability of the Bacterial lac Operon。 Science 1998 November 6; 282: 1133-1135. Godoy VG, Fox MS. Transposon stability and a role for conjugational transfer in adaptive mutability.Proc Natl Acad

20、 Sci U S A. 2000 Jun 20;97(13):7393-8.Bull HJ, McKenzie GJ, Hastings PJ, Rosenberg SM. Evidence that stationary-phase hypermutation in the Escherichia coli chromosome is promoted by recombination. Genetics. 2000 Apr

21、;154(4):1427-37.,基因突變及其機(jī)制,基因突變,,誘變,,堿基置換,移碼突變,點(diǎn)突變,,畸變,,缺失,添加,易位、倒位,自發(fā)突變,紫外線對(duì)DNA的損傷及其修復(fù),UV導(dǎo)致遺傳物質(zhì)產(chǎn)生嘧啶二聚體（TT、TC、CC），造成局部DNA分子無(wú)法配對(duì)，引起微生物的死亡或突變。一般微生物具有光復(fù)活作用。在利用UV進(jìn)行誘變育種等工作時(shí)，應(yīng)在紅光燈下進(jìn)行照射和后繼操作，并放置在黑暗條件下培養(yǎng)。,突變與育種,一、自發(fā)突變與育種

22、 （breeding by spontaneous mutation） 1.從生產(chǎn)中育種。 仔細(xì)觀察，做“伯樂(lè)” 2.定向培育優(yōu)良菌株。 卡介苗（BCG vaccine）：Bacillus Calmette-Guerin,A.Calmette,C.Guerin,誘變育種（breeding by induced mutation）,誘變育種是指利用物理、化學(xué)等誘變劑處理均勻而分散的微生物細(xì)胞群，在促

23、進(jìn)其突變率顯著提高的基礎(chǔ)上，采用簡(jiǎn)便、快速和高效的篩選方法，從中挑選出少數(shù)符合目的的突變株，以供科學(xué)試驗(yàn)和生產(chǎn)實(shí)踐使用。,誘變育種的幾個(gè)原則,1.選擇簡(jiǎn)便有效的誘變劑,誘變劑,,物理誘變劑：,化學(xué)誘變劑：,紫外線、激光、離子束、r－Ray,烷化劑、堿基類(lèi)似物等,很多種化學(xué)物質(zhì)，能以各種機(jī)制導(dǎo)致DNA的突變,,,a）利用各種誘變劑獲得各類(lèi)遺傳突變，進(jìn)行誘變育種；,b）對(duì)有害微生物進(jìn)行控制；,c）危害人類(lèi)自身的健康,“生物化學(xué)統(tǒng)一性”法則：

24、,人和細(xì)菌在DNA的結(jié)構(gòu)及特性方面是一致的，能使微生物發(fā)生突變的誘變劑必然也會(huì)作用于人的DNA，使其發(fā)生突變，最后造成癌變或其他不良的后果。,誘變劑的共性原則：化學(xué)藥劑對(duì)細(xì)菌的誘變率與其對(duì)動(dòng)物的致癌性成正比,超過(guò)95%的致癌物質(zhì)對(duì)微生物有誘變作用90%以上的非致癌物質(zhì)對(duì)微生物沒(méi)有誘變作用,回復(fù)突變(reverse mutation或back mutation)：突變體失去的野生型性狀，可以通過(guò)第二次突變得到恢復(fù)，這種第二次突

25、變稱(chēng)為回復(fù)突變,美國(guó)加利福尼亞大學(xué)的Bruce Ames教授于1966年發(fā)明，因此稱(chēng)為Ames試驗(yàn),具體操作：檢測(cè)鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonella typhmurium)組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株(his-)的回復(fù)突變率,Ames試驗(yàn),證明Ames試驗(yàn)重要性的應(yīng)用實(shí)例：,國(guó)外曾開(kāi)發(fā)了一種降低婦女妊娠反應(yīng)的藥物“反應(yīng)?！?，由于其藥效顯著，在60-70年代十分流行，但隨后人們就發(fā)現(xiàn)畸形兒的出生率明顯增高，而且生產(chǎn)畸形兒的婦女大多

26、曾服用“反應(yīng)?！保髞?lái)采用Ames試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這種物質(zhì)的確具有很強(qiáng)的致突變作用，因此這種藥物被禁止使用但如果能在這種藥物上市之前就進(jìn)行Ames試驗(yàn)檢測(cè)，那么這種大量出生畸形兒的悲劇完全可以避免，,第四節(jié) 基因突變及修復(fù),三、誘變劑與致癌物質(zhì)——Ames試驗(yàn),由于生物體內(nèi)、體外可能存在的差異，可在體外加入哺乳動(dòng)物（如大鼠）微粒體酶系統(tǒng)，使待測(cè)物活化，使Ames試驗(yàn)的準(zhǔn)確率達(dá)80-90%。,誘變育種的幾個(gè)基本原則,2.挑選優(yōu)良的出

27、發(fā)菌株,依靠經(jīng)驗(yàn),誘變育種的幾個(gè)基本原則,3.處理單細(xì)胞或單孢子懸液,誘變育種的細(xì)胞應(yīng)盡量選用單核細(xì)胞，絲狀菌應(yīng)選用單孢子。,誘變育種的幾個(gè)基本原則,4.選用最適的誘變劑量,劑量存活率曲線，劑量誘變率曲線。,誘變育種的幾個(gè)基本原則,5.充分利用復(fù)合處理的協(xié)同效應(yīng),誘變育種的幾個(gè)基本原則,6.利用和創(chuàng)造形態(tài)、生理與產(chǎn)量間的相關(guān)指標(biāo),利用蛋白酶水解圈、淀粉酶變色圈、纖維素水解圈等,誘變育種的幾個(gè)基本原則,7.設(shè)計(jì)高效篩選方案,8.創(chuàng)造新型篩

28、選方法,結(jié)合具體的目標(biāo)，大膽嘗試，勇于創(chuàng)新。,3類(lèi)突變株的篩選方法,1.產(chǎn)量突變株的篩選,2.抗藥性突變株的篩選,梯度平板法定向培育若干代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株,3.營(yíng)養(yǎng)缺陷 型突變株的篩選,基本培養(yǎng)基：MM,M9 medium：Na2HPO4 12.8g KH2PO4 3.0g NaCl 0.5g NH4Cl 0.5g 葡萄糖(單獨(dú)滅菌) 10.0g 維生素B1(單獨(dú)滅菌) 1μg/mlpH 自然,不能錯(cuò)誤的認(rèn)

29、為基本培養(yǎng)基均是簡(jiǎn)單的，不含生長(zhǎng)因子的。,完全培養(yǎng)基：CM,Pepton (蛋白胨) 5g Beef extract (牛肉膏) 30gNaCl 5g Agar (瓊脂) 15gDistilled water (蒸餾水) Adjust (調(diào)) pH to 7.0-7.2,可滿足一切營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株?duì)I養(yǎng)需要的天然或半組合培養(yǎng)基。,補(bǔ)充培養(yǎng)基：CM,例如：在M9培養(yǎng)基中添加L－His等,只能滿足相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型突