基于生物調(diào)控的Au納米顆粒合成及其細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)研究.pdf

1、納米材料具有獨特的物理和化學(xué)性質(zhì)，如大的比表面積、高的催化活性和生物相容性，已被廣泛地用于催化、能源、生物和分析等領(lǐng)域。隨著傳統(tǒng)的物理和化學(xué)制備納米材料方法的發(fā)展，近年來采用生物方法制備和組裝納米結(jié)構(gòu)材料的研究引起了廣泛的關(guān)注。生物合成的納米材料因富集大量生物活性分子被賦予獨特的物理化學(xué)特性、生物活性以及良好的分散性和穩(wěn)定性，使其在生物化學(xué)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。目前，已有多種生物包括細(xì)菌、放線菌、真菌以及一些高等植物用于合成金、銀、

2、硫化鎘、硫化鋅以及磁性氧化鐵等納米材料。與此同時，實現(xiàn)納米材料尺寸、形貌生物可控合成也成為納米生物合成新技術(shù)前沿研究領(lǐng)域之一。在本研究小組已有的納米生物技術(shù)研究工作基礎(chǔ)上，本論文瞄準(zhǔn)這一前沿研究方向，開展了納米材料生物可控合成技術(shù)的研究。以4株真菌包括青霉(Penicillium sp.)、出芽短梗霉(Aureobasidium pullulan)、鐮刀菌(Fusarium sp.)及尖孢鐮刀霉(Fusarium oxysporum)和

3、尖葉擬船蘚植物(Dolichomitriopsisdiversiformis)為生物材料，研究了不同真菌合成Au納米顆粒的生化合成機(jī)制；發(fā)展了細(xì)胞內(nèi)調(diào)控合成不同尺寸Au納米顆粒新方法；探索了D.diversiformis植物細(xì)胞外調(diào)控合成不同形貌Au納米材料的規(guī)律；并進(jìn)一步考察了富集不同生物活性分子Au納米顆粒的細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)，以及對腫瘤細(xì)胞毒性作用機(jī)制。以期為生物調(diào)控合成納米材料基礎(chǔ)性研究和進(jìn)一步應(yīng)用提供有益的探索。本論文研究工作具體

4、包括以下幾方面：
　　1.不同真菌合成Au納米顆粒生化合成機(jī)制研究
　　利用環(huán)境分離的A.pullulans、Fusarium sp.及F.oxysporum3株真菌發(fā)展了真菌細(xì)胞內(nèi)合成Au納米材料的生物方法，并對其合成的生化合成機(jī)制進(jìn)行了比較分析。將A.pullulans、Fusarium sp.和F.oxysporum細(xì)胞與氯金酸共孵育，3株真菌均可細(xì)胞內(nèi)合成Au納米顆粒；生化成分分析及FTIR光譜表征發(fā)現(xiàn)，A。pull

5、ulans細(xì)胞以還原糖為生物活性分子介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Au納米顆粒合成，而Fusariumsp.及F.oxysporum以蛋白質(zhì)為生物活性分子介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Au納米顆粒組裝：進(jìn)一步SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳分析表明，F(xiàn)usarium sp.細(xì)胞內(nèi)分子量為100 kDa，25 kDa和19 kDa的蛋白質(zhì)參與Au納米顆粒合成，而F.oxysporum細(xì)胞內(nèi)分子量為25kDa和19 kDa蛋白質(zhì)參與Au納米顆粒合成，A.pullulans合成的Au納米

6、顆粒不存在蛋白質(zhì)。研究結(jié)果將揭示3株真菌細(xì)胞不同的生物活性分子介導(dǎo)了Au納米材料的合成。通過采用LC-MS/MS法對蛋白質(zhì)分子進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明Fusariumsp.參與合成的Au納米顆粒的3個蛋白質(zhì)分別為脂膜ATP酶(plasma membraneATPase)、3-葡聚糖結(jié)合蛋白(3-glucan binding protein)及3-磷酸甘油脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)

7、，這些蛋白均為細(xì)胞能量代謝相關(guān)蛋白。細(xì)胞超薄切片表征發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)合成的Au納米顆粒均存在真菌細(xì)胞液泡中。時間動力學(xué)TEM結(jié)果表明，還原糖易于合成球形、單分散性Au納米顆粒，蛋白質(zhì)易于介導(dǎo)Au納米顆粒聚合體的組裝。
　　2.基于溫度調(diào)控真菌細(xì)胞內(nèi)合成不同尺寸Au納米顆粒研究
　　以溫度為調(diào)控因子，利用環(huán)境分離的真菌Penicillium sp.發(fā)展了一種細(xì)胞內(nèi)調(diào)控合成尺寸可控的Au納米顆粒新方法。將真菌Penicillium

8、sp.細(xì)胞與氯金酸共培育后，可在細(xì)胞內(nèi)合成球形的、單分散性的Au納米顆粒，粒徑分布18-35 nm。合成動力學(xué)TEM表征發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞吸收反應(yīng)溶液AuCl4-，在細(xì)胞內(nèi)首先被還原形成Au核，再組裝成Au納米顆粒。生物組分分析結(jié)果表明，Penicillium sp.細(xì)胞內(nèi)還原糖為活性組分介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Au納米顆粒的合成。通過控制合成反應(yīng)溫度，在4℃條件下，Penicillium sp.細(xì)胞可細(xì)胞內(nèi)合成4-10 nm粒徑的Au納米顆粒。在28℃則合

9、成20-37 nm粒徑顆粒，在不恒定的溫度條件下，Penicillium sp.細(xì)胞則合成多分散性的Au納米顆粒。TEM結(jié)果表明，純化的Au納米顆粒也表現(xiàn)為球形、單分散性等相似的特征。FTIR光譜表征表明，純化的Au納米顆粒存在1405cm-1多糖羰基伸縮振動。研究結(jié)果揭示通過控制反應(yīng)溫度條件，可實現(xiàn)真菌細(xì)胞內(nèi)對納米顆粒的尺寸控制。
　　3.基于pH調(diào)控植物細(xì)胞外合成不同形貌Au納米顆粒研究
　　利用尖葉擬船蘚(D.dive

10、rsiformis)植物體為生物材料，以pH為調(diào)控因子，發(fā)展了一種細(xì)胞外生物調(diào)控合成Au納米顆粒的新方法。將氯金酸鈉與過夜浸泡于不同pH溶液的蘚植物體混合液共孵育后，在pH3-6條件下，蘚植物體可合成球形、三角形、立方體等形貌的Au納米顆粒。生物組分分析發(fā)現(xiàn)，蘚植物蛋白質(zhì)為活性分子介導(dǎo)Au納米顆粒合成。PAGE分析表明，該蛋白質(zhì)分子量為71 kDa、等電點pI4.9。圓二色譜(Circular Dichroism，CD)表征發(fā)現(xiàn)，在不同

11、的pH溶液中該蛋白質(zhì)的二級構(gòu)象可以被誘導(dǎo)而改變。在pH3溶液中其二級結(jié)構(gòu)為無規(guī)則卷曲；pH4溶液中其二級結(jié)構(gòu)為中間過渡類型；pH5溶液中其二級結(jié)構(gòu)為α螺旋；而在pH6條件下其二級結(jié)構(gòu)為無規(guī)則卷曲，并伴隨三級的改變。進(jìn)一步的重組裝實驗結(jié)果揭示，該蘚植物蛋白在Au納米顆粒合成過程起著模板作用，并控制不同形貌Au納米顆粒的組裝。在pH3溶液中具有無規(guī)則卷曲二級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，可組裝三角形和球形兩種形貌Au納米顆粒，多分散性特征。pH4溶液中具有

12、中間過渡類型二級結(jié)構(gòu)的蘚蛋白質(zhì)，可組裝球形Au納米顆粒，單分散性好。pH5溶液中具有α螺旋二級結(jié)構(gòu)的蘚蛋白質(zhì)，可組裝立方體形形貌的Au納米顆粒。在pH6條件下具有無規(guī)則卷曲二級結(jié)構(gòu)，并伴隨三級改變的蛋白質(zhì)，組裝的Au納米顆粒為多分散性的球形。研究結(jié)果揭示通過控制合成pH條件，可實現(xiàn)以蛋白質(zhì)為活性分子的生物調(diào)控合成不同形貌納米顆粒。
　　4.不同真菌合成的Au納米顆粒細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)研究
　　利用Penicillium sp.、

13、Fusarium sp.和F.oxysporum真菌調(diào)控合成了不同生物分子組成的球形Au納米顆粒，研究了3種Au納米顆粒引起的肝癌細(xì)胞株BEL7404細(xì)胞生物學(xué)形態(tài)變化，細(xì)胞粘附性改變，以及對細(xì)胞活性影響等一系列細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)。實驗結(jié)果揭示，不同生物分子組成納米顆粒引起的細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)差異很大。Penicillium sp.細(xì)胞合成具有還原糖組成的Au納米顆粒對供試細(xì)胞BEL7404有較強的毒性，IC50為51μg。而Fusarium

14、sp.和F.oxysporum細(xì)胞合成的具有蛋白質(zhì)組成的Au納米顆粒對供試細(xì)胞BEL7404無毒性，具有較好的生物相容性?？梢?，利用生物合成不同生化組成的Au納米顆粒有望發(fā)展為納米載體或者潛在納米藥物應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。
　　5.基于蘚植物合成的蛋白質(zhì)Au納米顆粒細(xì)胞毒性機(jī)制研究
　　利用植物尖葉擬船蘚(D.diversiformis)合成了具有蛋白質(zhì)組成的球形Au納米顆粒，研究了蛋白質(zhì)Au納米顆粒與肝癌細(xì)胞株BEL740

15、4及肝正常細(xì)胞株L-02孵育后引起的細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)和細(xì)胞毒性及機(jī)制。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蘚合成具有蛋白質(zhì)組成的Au納米顆粒對細(xì)胞的毒性作用具有一定的選擇性，對肝癌細(xì)胞株BEL7404具有較強的毒性作用，且具有濃度依賴性。但對肝正常細(xì)胞株L-02毒性較小于肝癌細(xì)胞株。進(jìn)一步將蛋白質(zhì)Au納米顆粒與MCF-7及Hela等腫瘤細(xì)胞共孵育，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該顆粒對這2種腫瘤細(xì)胞均較強的毒性作用。利用流式細(xì)胞術(shù)分析該納米顆粒的選擇性作用機(jī)制表明，蛋白質(zhì)Au納米顆