發(fā)酵乳中污染菌和致病菌檢測技術(shù)體系建立及鑒定溯源技術(shù)研究.pdf

1、隨著我國食品安全問題愈發(fā)受到重視和食品工業(yè)的不斷進(jìn)步，食品工業(yè)產(chǎn)品必將摒棄終端控制而轉(zhuǎn)向過程控制，發(fā)酵乳作為生產(chǎn)工藝自動化程度較高的一類食品，污染菌和致病菌檢測體系和溯源技術(shù)就顯得尤為重要，因為化學(xué)污染物可以通過原料控制、工藝控制等環(huán)節(jié)實現(xiàn)控制甚至杜絕，而污染菌和致病菌存在很大程度的不可控性。本研究將發(fā)酵乳常見的污染菌和致病菌（沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、阪崎克羅諾桿菌、醋化醋桿菌、葡萄糖桿菌、葡糖醋桿菌和植物乳桿菌）作為研究對

2、象，將過程控制結(jié)合終端產(chǎn)品作為研究過程，通過特異性的選擇培養(yǎng)基、絕對定量的數(shù)字PCR技術(shù)、適用性強(qiáng)的依賴解旋酶等溫擴(kuò)增技術(shù)建立發(fā)酵乳中污染菌和致病菌的檢測體系，并通過高通量的二代測序技術(shù)完成發(fā)酵乳中污染菌和致病菌溯源技術(shù)的初步研究。
　　醋酸菌科特異性選擇培養(yǎng)基:葡萄糖50g/L，牛肉膏5g/L，酵母粉10 g/L，乙醇10mL/L，pH值6.8，0.1％膽鹽，1％瑞士染液。葡糖醋桿菌呈現(xiàn)紫黑色、有明顯的透明圈;醋化醋桿菌呈現(xiàn)酒紅

3、色、無明顯的透明圈;葡糖桿菌呈現(xiàn)粉紅色、無明顯的透明圈。
　　建立了活菌提取方法，通過Reagent D去除死菌，比較三種細(xì)菌基因組DNA提取方法，篩選得出FoodProof磁珠法提取細(xì)菌DNA雜質(zhì)最少純度最高。建立發(fā)酵乳中8株污染菌和致病菌的ddPCR檢測方法，確定ddPCR反應(yīng)體系為:2×ddPCR SuperMix10μL，1.2μL上下游引物（10μmol/L），0.4μL探針(10μmol/L)，4.4μL的模板，滅菌雙

4、蒸水補(bǔ)足20μL。確定ddPCR的反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性，10min;94℃變性，1min;56℃退火，45s;進(jìn)行40個循環(huán)，98℃10min。上述8株污染菌和致病菌的較適退火溫度分別為54℃、50.2℃、50.7℃、52.6℃、54.6℃、54℃、52.4℃、52.7℃。ddPCR方法檢測上述8株污染菌和致病菌特異性良好，非靶標(biāo)菌株無擴(kuò)增現(xiàn)象。人工污染發(fā)酵乳后，上述8株污染菌和致病菌生物檢測靈敏度分別為61CFU/g、33 CFU/

5、g、9.5CFU/g、81 CFU/g、72CFU/g、8.8CFU/g、89 CFU/g、96CFU/g。比較上述8株污染菌和致病菌的ddPCR檢測拷貝數(shù)和計數(shù)菌落數(shù)的偏差均在25％以內(nèi)，且104 CFU/g以內(nèi)與常規(guī)計數(shù)結(jié)果保持良好的線性關(guān)系(標(biāo)準(zhǔn)曲線R2均大于0.99)，證明ddPCR檢測酸奶中污染菌和致病菌絕對定量的準(zhǔn)確性。
　　建立發(fā)酵乳中8株污染菌和致病菌的HDA檢測方法，確定該方法反應(yīng)體系為:5μL10×buffer

6、(100mM二硫蘇糖醇、350 mM Tris-HAc、100mM MgSO4、1mg/mLBSA),0.04μM dNTPs,0.16μMATP,10U Bst ploymerase,0.1μg UvrD helicase,5.0μgT4 gp32，25μM海藻糖，2μL模板DNA，20 pmol引物，用ddH2O補(bǔ)至50μL（其中上述8株污染菌和致病菌較適UvrD helicase、T4 gp32終濃度分別為0.1μg、5.0μg;

7、0.1μg、5.0μg;0.1μg、4.0μg;0.1μg、5.0μg;0.15μg、4.0μg;0.1μg、5.0μg;0.1μg、5.0μg;0.15μg、5.0μg）。反應(yīng)條件為:65℃恒溫2h。HDA方法檢測上述8株污染菌和致病菌特異性良好，非靶標(biāo)菌株無擴(kuò)增現(xiàn)象，經(jīng)測序比對，同源性均為100％。發(fā)酵乳經(jīng)人工污染后，上述8株污染菌和致病菌生物檢測靈敏度分別為2.6×102 CFU/g、3.3×101 CFU/g、2.3×101 C

8、FU/g、1.6×101 CFU/g、6.8×101 CFU/g、4.3×101 CFU/g、1.0×102CFU/g、2.8×101 CFU/g。初步對HDA方法進(jìn)行了改良，將T4 gp32蛋白替換為終濃度為3.0μg RecA蛋白和加入10U Phi29嗜溫聚合酶可以縮短HDA法檢測時間，提高檢測速率;而多胺沒有作用;確定了肉眼可見較適的短鏈DNA直觀檢測SYBR GreenⅠ終濃度為40×。
　　初步建立了發(fā)酵乳中污染菌和致

9、病菌鑒定與溯源技術(shù)的研究方法，設(shè)置了原料乳、輔料、車間空氣、手部涂抹、工裝、包材、灌注管、成品共計8個采樣點，通過采樣點的處理、不同采樣點的標(biāo)記、二代測序，獲得530673條有效序列，長度471bp的序列為529346條。測序結(jié)果的稀釋曲線能夠涵蓋8個采樣點中足夠多的細(xì)菌類別，具有充足的測序深度。測序結(jié)果的豐度和多樣性指數(shù)(Chao1、Ace、Shannon、Simpson)顯示測序結(jié)果能夠真實的反應(yīng)樣品中的微生物種群分布情況。原料乳采

10、樣環(huán)節(jié)屬水平菌群結(jié)構(gòu)分布較為均勻，輔料采樣環(huán)節(jié)屬水平菌群結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，車間空氣采樣環(huán)節(jié)屬水平菌群結(jié)構(gòu)分布相對單一，手部涂抹采樣環(huán)節(jié)屬水平菌群結(jié)構(gòu)分布較為均衡且種類較多，工裝采樣環(huán)節(jié)屬水平菌群結(jié)構(gòu)分布較為平均，包材采樣環(huán)節(jié)屬水平菌群結(jié)構(gòu)分布不均衡，灌注管采樣環(huán)節(jié)屬水平菌群結(jié)構(gòu)分布較為單一，成品采樣環(huán)節(jié)屬水平菌群結(jié)構(gòu)分布主要以乳桿菌屬、鏈球菌屬為主。溯源分析結(jié)果顯示，葡萄球菌屬的關(guān)鍵控制點的危害強(qiáng)度:工裝＞車間空氣＞手部涂抹＞灌注管＞原料乳