NLRP3炎癥體在對(duì)比劑急性腎損傷發(fā)病中的作用.pdf

1、【目的】
　　對(duì)比劑引起的急性腎損傷（contrast-induced acute kidney injury，CI-AKI）已成為院內(nèi)獲得性急性腎損傷的重要原因，其主要病理改變?yōu)槟I臟小管上皮細(xì)胞損傷。目前研究發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)參與了CI-AKI的進(jìn)程。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain[NOD]-like receptor protein3，NLRP3

2、）是固有免疫的重要受體，在多種腎臟固有細(xì)胞如小管上皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞和足細(xì)胞上均有表達(dá)，受外界刺激活化可后與凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC）結(jié)合形成NLRP3炎癥體，進(jìn)一步活化半胱氨酸蛋白酶1（caspase-1），引起白介素18（Interleukin-18 IL-18）與白介素1β（Interleukin-1βIL-1β）的成熟

3、與釋放，參與炎癥反應(yīng)。本文擬探討：
　　1.對(duì)比劑對(duì)正常人腎小管上皮細(xì)胞的影響。
　　2.NLRP3炎癥體在對(duì)比劑損傷HK-2細(xì)胞過(guò)程中的作用。
　　3.制備CI-AKI小鼠模型。
　　4. NLRP3基因在小鼠CI-AKI模型中的作用。
　　【方法】
　　1.培養(yǎng)人腎小管上皮細(xì)胞（Human Kidney-2 HK-2）。
　　實(shí)驗(yàn)分為：
　　1、正常對(duì)照組；
　　2、歐乃派克組；

4、
　　3、威視派克組；
　　4、甘露醇組。
　　通過(guò)CCK-8法檢測(cè)HK-2細(xì)胞活性；real time-PCR與Western Blot技術(shù)檢測(cè)對(duì)比劑刺激后NLRP3和ASC mRNA與蛋白水平的變化；流式細(xì)胞儀檢測(cè)HK-2細(xì)胞凋亡情況。
　　2.培養(yǎng)人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2 cell）。實(shí)驗(yàn)分為：1.正常對(duì)照組；2.歐乃派克組；
　　3.甘露醇組。運(yùn)用siRNA沉默NLRP3炎癥體相關(guān)蛋白NLRP3與

5、ASC。通過(guò)real time-PCR檢驗(yàn)siRNA沉默靶基因的效果；流式細(xì)胞儀檢測(cè)HK-2細(xì)胞凋亡情況；Western Blot技術(shù)檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白BCL-2、BAX、caspase-3/cleaved caspase-3、caspase-8/cleaved caspase-8、caspase-9/cleaved caspase-9水平與NLRP3炎癥體相關(guān)蛋白NLRP3、ASC、caspase-1/cleaved caspase-1

6、水平變化，ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清中IL-1β與IL-18含量變化。
　　4.結(jié)合文獻(xiàn)綜合考慮后，我們引入單側(cè)腎切除、脫水與尾靜脈注射速尿作為預(yù)處理方法。本部分實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了如下造模方法，嘗試尋找合適的CI-AKI小鼠模型：8周齡20g左右雄性C57BL/6小鼠54只，除對(duì)照組外均行單側(cè)腎切除，正常飼養(yǎng)四周后分組：
　　1、對(duì)照組（組1）；
　　2、速尿組：尾靜脈注射10ul/g速尿（組2）；
　　3、速尿+對(duì)比劑組：

7、尾靜脈注射10ul/g速尿，20min后注射歐乃派克10ul/g（組3）；
　　4、24h脫水+速尿組：禁水24h后尾靜脈注射10ul/g速尿（組4）；
　　5、24h脫水+速尿+對(duì)比劑組：禁水24h后尾靜脈注射10ul/g速尿，20min后注射歐乃派克10ul/g（組5）；
　　6、48h脫水+速尿組：禁水48h后尾靜脈注射10ul/g速尿（組6）；
　　7、48h脫水+速尿+對(duì)比劑組：禁水48h后尾靜脈注射1

8、0ul/g速尿，20min后注射歐乃派克10ul/g（組7）；
　　8、72h脫水+速尿組：禁水72h后尾靜脈注射10ul/g速尿（組8）；
　　9、72h脫水+速尿+對(duì)比劑組：禁水72h后尾靜脈注射10ul/g速尿，20min后注射歐乃派克10ul/g（組9）。造模24h后處死小鼠，檢測(cè)小鼠血清肌酐含量變化。
　　4.引入NLRP3-/-小鼠，以雄性C57BL/6小鼠作為對(duì)照。選用18只8周齡雄性NLRP3-/-小鼠

9、+18只8周齡雄性野生型C57BL/6小鼠，實(shí)驗(yàn)分組：
　　1、WideTpye對(duì)照組；
　　2、Widetype預(yù)處理組：小鼠行單側(cè)腎切除，正常飼養(yǎng)四周，禁水24h，速尿10ul/g尾靜脈注射；
　　3、Widetype造模組：小鼠行單側(cè)腎切除，正常飼養(yǎng)四周，禁水24h，速尿10ul/g尾靜脈注射，20min后歐乃派克尾靜脈注射（10ul/g）；
　　4、NLRP3-/-對(duì)照組：正常喂養(yǎng)。
　　5、NLR

10、P3-/-預(yù)處理組：小鼠行單側(cè)腎切除，正常飼養(yǎng)四周，禁水24h，速尿10ul/g尾靜脈注射；
　　6、NLRP3-/-造模組：小鼠行單側(cè)腎切除，正常飼養(yǎng)四周，禁水24h，速尿10ul/g尾靜脈注射，20min后歐乃派克尾靜脈注射（10ul/g）。
　　通過(guò)HE染色觀察腎臟結(jié)構(gòu)變化；westernblot技術(shù)檢測(cè)小鼠腎組織中凋亡相關(guān)蛋白與 NLRP3炎癥體相關(guān)蛋白含量含量變化；Tunel染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡；免疫組化檢測(cè)NLRP3

11、炎癥體相關(guān)蛋白表達(dá)。
　　【結(jié)果】
　　1.低滲對(duì)比劑歐乃派克與等滲對(duì)比劑威視派克均可誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞活力下降（p<0.05），僅有歐乃派克刺激HK-2細(xì)胞后導(dǎo)致NLRP3、ASC mRNA與蛋白水平升高（p<0.05）。歐乃派克可誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡（p<0.05）。
　　2.RNA干擾降低HK-2細(xì)胞內(nèi)NLRP3 mRNA與ASC mRNA水平，歐乃派克可誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞中NLRP3炎癥體相關(guān)蛋白NLRP3、ASC

12、、cleaved caspase-1，細(xì)胞上清中IL-18與IL-1β蛋白水平升高，沉默NLRP3基因或ASC基因抑制炎癥體活化。歐乃派克誘導(dǎo)HK-2凋亡；誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞中促凋亡蛋白 BAX、caspase-3/cleaved caspase-3、caspase-8/cleaved caspase-8水平顯著升高（p<0.05）。抑凋亡蛋白BCL-2水平顯著下降（p<0.05）。沉默NLRP3或ASC基因減輕歐乃派克誘導(dǎo)的HK-2凋亡

13、；減輕細(xì)胞中促凋亡蛋白BAX、caspase-3/cleaved caspase-3、caspase-8/cleaved caspase-8水平升高（p<0.05）及抑凋亡蛋白BCL-2水平降低（p<0.05）。
　　3.與對(duì)照組相比，速尿+對(duì)比劑組、脫水24h+速尿組、脫水24h+速尿+對(duì)比劑組、脫水48h+速尿組、脫水48h+速尿+對(duì)比劑組、脫水72h+速尿組、脫水72h+速尿+對(duì)比劑組血清肌酐顯著升高（p<0.05，p<0.

14、01）。與脫水24h+速尿組相比，脫水24h+速尿+對(duì)比劑組肌酐顯著升高（p<0.05）；脫水48h+速尿組與脫水48h+速尿+對(duì)比劑組相比，肌酐無(wú)顯著差異（p>0.05）；脫水72h+速尿組與脫水72h+速尿+對(duì)比劑組相比，肌酐無(wú)顯著差異（p>0.05）。
　　4.Widetype造模組小鼠腎組織中NLRP3炎癥體相關(guān)蛋白NLRP3、ASC、cleaved caspase-1水平升高（p<0.05）；促凋亡蛋白BAX、cleav

15、ed caspase-3水平升高（p<0.05）。抑凋亡蛋白BCL-2水平降低（p<0.05）；腎臟皮髓交界處細(xì)胞凋亡（p<0.05），腎臟小管損傷，結(jié)構(gòu)破壞（p<0.05）。NLRP3-/-小鼠腎組織中的NLRP3炎癥體通路被阻斷。與Widetype造模組相比，NLRP3-/-造模組可減輕腎組織中促凋亡蛋白BAX、cleaved caspase-3水平升高（p<0.05）與抑凋亡蛋白BCL-2水平降低（p<0.05）；NLRP3-/-

16、造模組腎臟皮髓交界處細(xì)胞凋亡較Widetype造模組減輕（p<0.01）；腎小管損傷較Widetype造模組減輕（p<0.01）。
　　【結(jié)論】
　　1.對(duì)比劑可活化HK-2細(xì)胞中NLRP3炎癥體。
　　2.低滲對(duì)比劑歐乃派克可誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡，阻斷NLRP3炎癥體通路可減輕對(duì)比劑引起的細(xì)胞凋亡。
　　3.單側(cè)腎切除+脫水24h+速尿10ul/g+歐乃派克是一種較好的低滲對(duì)比劑造CI-AKI小鼠模型的方法。<