Integrinα9在人ADSCs向LECs分化過程中表達(dá)變化的相關(guān)研究.pdf

1、目的：從人體脂肪組織中分離培養(yǎng)出脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞(Adipose-derived stem cells，ADSCs)，誘導(dǎo)其向淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞(Lymphatic endothelial cells，LECs)分化，同時(shí)探討分化過程中整合蛋白α9(integrinα9)表達(dá)的變化，旨在尋找淋巴水腫分子治療靶點(diǎn)，為ADSCs應(yīng)用于淋巴水腫的分子治療奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：
　?、購奈g(shù)后廢棄的人體脂肪組織中分離培養(yǎng)出AD

2、SCs，倒置相差顯微鏡觀察原代及傳代細(xì)胞的形態(tài)特征。
　?、诹魇郊?xì)胞儀(FCM)檢測第三代ADSCs表面特征性抗原的表達(dá)，達(dá)到鑒定ADSCs的目的;MTT法繪制生長曲線，明確傳代過程中細(xì)胞生長情況是否發(fā)生改變。
　　③用人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子C(VEGF-C)、人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子A(VEGF-A)、血小板源性生長因子BB(PDGF-BB)誘導(dǎo)其向LECs方向分化，同時(shí)以人LECs作為陽性對(duì)照組。
　?、躓ester

3、n Blot檢測各組細(xì)胞LECs表面特征性抗原淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞透明質(zhì)酸受體-1(LYVE-1)、血管內(nèi)皮細(xì)胞特征性抗原CD34及integrinα9的表達(dá)，明確實(shí)驗(yàn)組向LECs的分化，同時(shí)探討integrinα9在誘導(dǎo)前后表達(dá)的變化。
　　⑤流式細(xì)胞儀(FCM)檢測各組細(xì)胞周期，分析分化前后細(xì)胞周期的改變，使用SPSS17.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果：
　?、貯DSCs貼壁生長，呈長梭形，對(duì)密度的依賴性較高，傳

4、代后細(xì)胞生長速度明顯增快，第1、3、5代細(xì)胞生長曲線均為典型的“S”形。
　?、贔CM檢測抗原結(jié)果:CD29、CD90陽性表達(dá)，CD34、CD45陰性表達(dá)，與MSCs的特性相符合。
　?、踂estern Blot結(jié)果顯示:陽性對(duì)照組中LECs表面特征性抗原LYVE-1的表達(dá)為陽性，血管內(nèi)皮細(xì)胞表面特征性抗原CD34為陰性表達(dá)，而integrinα9的表達(dá)與LYVE-1的表達(dá)趨勢一致，亦為陽性表達(dá);實(shí)驗(yàn)組LYVE-1亦為陽性表

5、達(dá)、且CD34為陰性表達(dá)，明確了LECs的生成，integrinα9為陽性表達(dá)，同時(shí)LYVE-1及integrinα9的表達(dá)水平低于二者在陽性對(duì)照組中的表達(dá);陰性對(duì)照組中LYVE-1、integrinα9及CD34的表達(dá)均為陰性。
　?、蹻CM檢測各組細(xì)胞周期，分析各組細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例，其中實(shí)驗(yàn)組(65.46±2.73)％、陽性對(duì)照組(62.35±0.50)％明顯小于陰性對(duì)照組(88.79±1.53)％，使用方差分析比較三

6、組細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例的差異（F=186.77，P＜0.01），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SNK法進(jìn)行兩兩比較，實(shí)驗(yàn)組G0/G1期百分比顯著小于陰性對(duì)照組(q=22.06，P＜0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;陽性對(duì)照組G0/G1期百分比顯著小于陰性對(duì)照組(q=25.01，P＜0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)組與陽性對(duì)照組之間G0/G1期百分比無明顯差異(q=2.94，P=0.083＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　①ADSC

7、s貼壁生長、長梭形，原代培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的集落生長趨勢，且對(duì)密度的依賴性高，傳代后細(xì)胞增殖速率明顯增強(qiáng)，傳代后細(xì)胞的形態(tài)及生長情況不發(fā)生明顯改變，傳代后細(xì)胞的純度較高，可用于ADSCs向LECs分化的研究。
　　②使用VEGF-A、VEGF-C及PDGF-BB可成功將ADSCs誘導(dǎo)分化為LECs（LYVE-1表達(dá)陽性、CD34表達(dá)陰性，證實(shí)了LECs的生成），ADSCs具有向LECs分化的潛能，在對(duì)各組細(xì)胞周期進(jìn)行檢測的時(shí)候我們