VEGF-MMP-13在體外培養(yǎng)的下頜骨髁突軟骨鈣化過(guò)程中表達(dá)變化的研究.pdf

1、顳下頜關(guān)節(jié)（Temporomandibular joint TMJ）在顱頜面生長(zhǎng)及功能方面起著重要的作用。不同于長(zhǎng)骨關(guān)節(jié)，當(dāng)顳下頜關(guān)節(jié)受到創(chuàng)傷后，其關(guān)節(jié)腔內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變，極易引起下頜骨髁突軟骨（Mandibular condylar cartilage，MCC）發(fā)生病理性改變，可能導(dǎo)致顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎（Temporomandibular joint osteoarthritis,TMJ OA）等疾病的發(fā)生，進(jìn)而下頜骨髁突軟骨失去生長(zhǎng)能

2、力而加速了軟骨內(nèi)成骨（EO， Endochondral Ossification）[1]，最終髁突病理性鈣化。正常軟骨組織中，II型膠原（Type II collagen，Col II）占整個(gè)軟骨干重的60％，Col II的裂解和崩塌將直接導(dǎo)致軟骨結(jié)構(gòu)被破壞，同時(shí)加速炎癥的激發(fā)導(dǎo)致疾病的惡性循環(huán)，最終軟骨鈣化。基質(zhì)金屬蛋白酶13（Matrix metalloproteinases-13，MMP-13）對(duì)多種廣泛存在于細(xì)胞外基質(zhì)（Extr

3、acellular matrix，ECM）中的蛋白具有強(qiáng)有效的降解作用[2]，尤其對(duì)Col II的破壞，是其他膠原酶的10~30倍[3]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growth factor， VEGF）可以在促進(jìn)軟骨血管化的同時(shí)促進(jìn)MMP-13的產(chǎn)生、抑制其抑制劑TIMP-1及TIMP-2的表達(dá)，加速OA進(jìn)程[4]。透明質(zhì)酸（Hyaluronic Acid,HA）可以有效緩解OA的進(jìn)程[5]，TGF-

4、β1則通過(guò)下調(diào)mir-140的活性加速OA進(jìn)程[6]。本課題采取下頜骨髁突軟骨及長(zhǎng)骨軟骨小組織塊體外培養(yǎng)的方法，檢測(cè)下頜骨髁突軟骨鈣化過(guò)程中及長(zhǎng)骨軟骨中VEGF及MMP-13的表達(dá)變化。接著通過(guò)在培養(yǎng)基中加入相應(yīng)濃度的HA或TGF-β1，觀察下頜骨髁突軟骨的鈣化情況，并檢測(cè)VEGF/MMP-13蛋白在其中的表達(dá)變化。為今后臨床上對(duì)TMJ OA的研究和診治提供一定的理論依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　本實(shí)驗(yàn)均采用小組織塊體外培養(yǎng)的

5、方法。實(shí)驗(yàn)一：在超凈工作臺(tái)內(nèi)，于體視顯微鏡下將新生3d的昆明小鼠仔鼠斷頭處死，取其下頜骨髁突軟骨及長(zhǎng)骨軟骨（脛骨、股骨頭軟骨）組織。將獲得的軟骨小組織塊隨機(jī)均分為2組，設(shè)置其中一組為“未培養(yǎng)對(duì)照組”，給予直接固定；另一組設(shè)置為“培養(yǎng)對(duì)照組”置于空白的IMDM培養(yǎng)液中行體外培養(yǎng)，6周后采用體視顯微鏡觀察其形態(tài)學(xué)變化，HE染色觀察組織結(jié)構(gòu)變化。通過(guò)茜素紅及堿性磷酸酶染色（ALP）染色判斷組織鈣化變化。使用IPP6.0（Image-Pro p

6、lus6.0）軟件測(cè)量軟骨面積的變化情況。運(yùn)用免疫組織化學(xué)染色的辦法并通過(guò)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，檢測(cè)培養(yǎng)對(duì)照組髁突及長(zhǎng)骨軟骨組織中VEGF及MMP-13蛋白的表達(dá)變化；實(shí)驗(yàn)二：僅對(duì)有鈣化發(fā)生的下頜骨髁突軟骨加以研究。在實(shí)驗(yàn)一的基礎(chǔ)上，設(shè)置該組髁突軟骨為HA組，在IMDM培養(yǎng)液中加入0.5mg/ml的HA，體外培養(yǎng)6周后，觀察下頜骨髁突軟骨的鈣化情況，采取同樣的方法檢測(cè)VEGF及MMP-13蛋白的表達(dá)變化，并與培養(yǎng)對(duì)照組的結(jié)果行比較分析；實(shí)驗(yàn)三：

7、將5ng/ml的TGF-β1加入培養(yǎng)基中，培養(yǎng)6周后觀察TGF-β1作用下下頜骨髁突軟骨的鈣化情況，采用與實(shí)驗(yàn)一相同的方法檢測(cè)VEGF/MMP-13的表達(dá)變化，并與培養(yǎng)對(duì)照組行比較分析；所有數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，研究VEGF/MMP-13在體外培養(yǎng)的下頜骨髁突軟骨鈣化過(guò)程中的表達(dá)變化。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1、髁突軟骨在體外培養(yǎng)6w后軟骨發(fā)生鈣化，VEGF及MMP-13的表達(dá)量增加。
　　髁突軟骨組織在空白

8、的IMDM培養(yǎng)液培養(yǎng)6w后（培養(yǎng)對(duì)照組），體視顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)在髁突軟骨內(nèi)出現(xiàn)拱形的高密度光阻射區(qū)。ALP及茜素紅染色表明，與培養(yǎng)前（未培養(yǎng)對(duì)照組）比較，培養(yǎng)6w后所形成的光阻射區(qū)為鈣化區(qū)域。HE染色示：培養(yǎng)6w后，髁突軟骨層變薄，層次不清，部分軟骨細(xì)胞出現(xiàn)肥大分化，部分ECM區(qū)域出現(xiàn)嗜堿性藍(lán)染。免疫組化及陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)分析示：VEGF及MMP-13陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)在培養(yǎng)6w后均有增加，軟骨鈣化區(qū)域ECM中VEGF及MMP-13陽(yáng)性表達(dá)。說(shuō)明

9、下頜骨髁突軟骨鈣化的發(fā)生伴隨著ECM中VEGF/MMP-13的陽(yáng)性表達(dá)和陽(yáng)性細(xì)胞的增多。
　　2、長(zhǎng)骨軟骨未查及鈣化發(fā)生，軟骨組織表面積增大。
　　長(zhǎng)骨軟骨（脛骨、股骨頭軟骨）在培養(yǎng)6w后，在體視顯微鏡下，均未發(fā)現(xiàn)光阻射區(qū)形成，ALP及茜素紅染色結(jié)果證明，長(zhǎng)骨軟骨在培養(yǎng)后未發(fā)生鈣化。HE染色示：長(zhǎng)骨軟骨在培養(yǎng)6w后，層次依然清晰，ECM區(qū)域未查及嗜堿性藍(lán)染。免疫組化及陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果表明，培養(yǎng)6w后，長(zhǎng)骨軟骨VEGF及MMP

10、-13陽(yáng)性細(xì)胞增加。測(cè)量軟骨表面積結(jié)果表明，培養(yǎng)6w后長(zhǎng)骨軟骨表面積明顯增加。證明長(zhǎng)骨軟骨與髁突軟骨不同，在相同培養(yǎng)環(huán)境下，長(zhǎng)骨軟骨可以繼續(xù)生長(zhǎng)，未發(fā)生鈣化。
　　3、HA組下頜骨髁突軟骨基質(zhì)未發(fā)生鈣化，同時(shí)伴隨著VEGF/MMP-13陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少。
　　髁突軟骨組織在配有HA的IMDM培養(yǎng)液培養(yǎng)6w后，體視顯微鏡下未觀察到光阻射區(qū)的形成，ALP及茜素紅染色均未查及髁突軟骨鈣化區(qū)域，HE染色結(jié)果表明，髁突軟骨在含有HA的培

11、養(yǎng)液中培養(yǎng)6w后，軟骨增厚，層次尚可辨認(rèn)，ECM內(nèi)嗜堿性藍(lán)染陰性。測(cè)量軟骨表面積結(jié)果表明，培養(yǎng)6w后，髁突軟骨表面積有所增加。說(shuō)明在HA的作用下，體外培養(yǎng)的下頜骨髁突軟骨未發(fā)生鈣化。免疫組化染色結(jié)果顯示，HA組髁突軟骨ECM中未檢測(cè)到VEGF及MMP-13蛋白的表達(dá)。陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果表明，與培養(yǎng)對(duì)照組比較，HA組的下頜骨髁突軟骨中VEGF及MMP-13陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少。
　　4、TGF-β1可以促進(jìn)下頜骨髁突軟骨鈣化，同時(shí)伴隨著V

12、EGF/MMP-13表達(dá)升高。
　　髁突軟骨組織在加有TGF-β1的IMDM培養(yǎng)液培養(yǎng)6w后，體視顯微鏡下光阻射區(qū)形成，且面積與較培養(yǎng)對(duì)照組相比呈現(xiàn)出增大的趨勢(shì)。ALP及茜素紅染色結(jié)果證明， TGF-β1組髁突鈣化更為嚴(yán)重。HE染色提示髁突軟骨肥大樣分化，ECM區(qū)域大片嗜堿性藍(lán)染，軟骨細(xì)胞層次混亂，部分軟骨細(xì)胞破裂。說(shuō)明TGF-β1可以促進(jìn)髁突軟骨的鈣化。免疫組化染色結(jié)果顯示，軟骨鈣化的區(qū)域可以檢測(cè)到VEGF/MMP-13的表達(dá)。

13、陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果顯示，TGF-β1組下頜骨髁突軟骨中VEGF及MMP-13的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較培養(yǎng)對(duì)照組增多。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論：
　　1、下頜骨髁突軟骨不同于長(zhǎng)骨軟骨，在體外培養(yǎng)條件下，髁突發(fā)生鈣化；而長(zhǎng)骨軟骨能夠繼續(xù)生長(zhǎng)而未有鈣化發(fā)生。故實(shí)驗(yàn)二、實(shí)驗(yàn)三僅對(duì)有鈣化表現(xiàn)的髁突做進(jìn)一步研究。
　　2、下頜骨髁突軟骨鈣化過(guò)程中，其軟骨細(xì)胞外基質(zhì)鈣化的區(qū)域伴有VEGF/MMP-13陽(yáng)性表達(dá)。
　　3、在體外培養(yǎng)條件下，HA組下