輻射脅迫下耐輻射動球菌中sRNA對耐輻射相關(guān)的RecBCD的調(diào)控作用.pdf

1、耐輻射動球菌（Kineococcus radiotolerans）是一種革蘭氏陽性菌，分離自核污染廢料堆，它具有對強(qiáng)堿、高鹽、高金屬離子濃度、高化學(xué)毒性、高滲透壓以及γ射線等的極端抗性，其輻射抗性是因為K.radiotolerans自身高效而準(zhǔn)確的DNA修復(fù)系統(tǒng)。RecBCD途徑是細(xì)菌中主要的同源重組修復(fù)途徑之一，作用于DNA雙鏈斷裂修復(fù)。DNA雙鏈斷裂(DSBs)修復(fù)對于細(xì)胞活性和同源重組具有重要的意義。sRNA（small non-

2、coding RNA）在細(xì)菌中已被證實是基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)子，通常是缺少蛋白編碼功能的，它作用于mRNA的翻譯或降解，有時候也直接調(diào)節(jié)某種蛋白功能。sRNA對基因表達(dá)的調(diào)控主要是由sRNA與mRNA間基于短且不完全堿基互補(bǔ)配對的相互作用實現(xiàn)。
　　對K.radiotolerans按0、2、4、6、8、10、12kGy輻照4h后進(jìn)行qRT-PCR分析，結(jié)果表明，隨著輻照強(qiáng)度的增加，RecBCD的表達(dá)量也隨之提高，表明RecBCD是與

3、K.radiotolerans的抗輻射特性相關(guān)的蛋白。本論文針對由生物信息學(xué)軟件預(yù)測出的可能與RecBCD5'UTR發(fā)生相互作用的5條sRNA進(jìn)行驗證，分別是sKRA059、sKRA214、sKRA155、sKRA051和sKRA125。由于K.radiotolerans存在細(xì)胞壁厚、生長抱團(tuán)的問題，導(dǎo)致無法轉(zhuǎn)入外源DNA，因此利用粘液素潤滑抗粘附的特性解決K.radiotolerans抱團(tuán)生長的問題，但在非抱團(tuán)生長的基礎(chǔ)上仍然無法轉(zhuǎn)入

4、外源DNA。利用大腸桿菌作為外源宿主，共轉(zhuǎn)化含有RecBCD5'UTR序列的綠色熒光蛋白報告質(zhì)粒(5'UTR∷gfp)與含有sRNA的表達(dá)質(zhì)粒，并通過流式分析以及Western blotting檢測GFP的熒光表達(dá)與蛋白表達(dá)情況，以分析相關(guān)sRNA對RecBCD蛋白的調(diào)控機(jī)制。
　　流式分析結(jié)果顯示質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化前后，GFP表達(dá)的熒光強(qiáng)度沒有顯著差異。Western blotting結(jié)果表明質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化前后，GFP蛋白表達(dá)也沒有明顯差異