耐輻射異常球菌鐵蛋白DrfE的抗氧化功能分析.pdf

1、鐵是生物體正常生長不可或缺的元素，而細(xì)胞內(nèi)過量的鐵離子會(huì)引起Fenton反應(yīng)而產(chǎn)生ROS，從而導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷。已有研究表明生物體中，鐵蛋白具有氧化脅迫抗性、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鐵離子濃度等作用。極端耐輻射異常球菌(Deinococcus radiodurans)抗氧化基因組序列分析，發(fā)現(xiàn)一個(gè)的類鐵蛋白編碼基因(drB0118)，已有的研究表明該蛋白失活導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)干燥脅迫敏感，但在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鐵離子濃度及氧化脅迫抗性的作用尚無報(bào)道。本研究通過生物信

2、息學(xué)分析、基因突變和異源表達(dá)等方法對(duì)DrfE蛋白的抗氧化功能進(jìn)行初步研究，主要取得如下研究結(jié)果：
　　(1)利用生物信息學(xué)方法，對(duì)耐輻射異常球菌DrfE進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)drfE位于耐輻射異常球菌基因組大質(zhì)粒上，該蛋白由337個(gè)氨基酸組成，含有一個(gè)與鐵蛋白類似保守結(jié)構(gòu)域，屬于鐵蛋白2超家族。因此，將該蛋白命名為DrfE(Deinococcus radiodurans Ferritin，DrfE)。其氨基酸序列分析表明，該蛋白

3、具有明顯的跨膜結(jié)構(gòu)和蛋白疏水區(qū)，是一類典型的跨膜蛋白。
　　(2)為了研究耐輻射異常球菌 drfE的功能，本研究采用融合PCR和體內(nèi)同源重組的方法成功構(gòu)建了drfE基因的缺失突變株（ΔdrfE）和功能回補(bǔ)菌株（pdrfE::Δ）。脅迫沖擊實(shí)驗(yàn)顯示，drfE基因缺失導(dǎo)致耐輻射異常球菌對(duì)氯化鈉和過氧化氫敏感，80mM H2O2處理30min后，突變株比野生型菌株的生存力低4個(gè)數(shù)量級(jí)，5M NaCl處理6h導(dǎo)致突變株的生存力降低2個(gè)數(shù)量

4、級(jí)，且回補(bǔ)株能夠完全恢復(fù)突變株ΔdrfE的表型。
　　(3)對(duì)野生型DR、突變株ΔdrfE和回補(bǔ)菌株pdrfE::Δ中體內(nèi)過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定的結(jié)果表明，在正常培養(yǎng)條件下，drfE基因缺失導(dǎo)致耐輻射異常球菌CAT和SOD活性下降(突變株的酶活分別下降28.36％和6.42%)；而氧化脅迫(80mM H2O2處理30min)條件下,差異尤為顯著(突變株酶活下降32.33%和41.30%)。進(jìn)一步對(duì)胞

5、內(nèi)Fe2+含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示drfE基因缺失引起耐輻射異常球菌細(xì)胞中胞內(nèi)Fe2+含量增加了26%，達(dá)293μmol/L。
　　(4)將耐輻射異常球菌DrfE蛋白異源表達(dá)在大腸桿菌中，表型分析結(jié)果表明，DrfE蛋白明顯增強(qiáng)了大腸桿菌對(duì)氯化鈉和過氧化氫的脅迫抗性。在15mM H2O2處理10min條件下，DrfE蛋白異源表達(dá)的大腸桿菌生存力增加了2個(gè)數(shù)量級(jí)，1.5M NaCl處理6h條件下，其生存力增加1個(gè)數(shù)量級(jí)。
　　總之