營養(yǎng)脅迫下耐輻射異常球菌全局調(diào)控蛋白CarD的負調(diào)節(jié)機制.pdf

1、營養(yǎng)脅迫是細菌生理過程中最普遍的環(huán)境脅迫因子，細菌通過控制rRNA合成以及信號分子(p)ppGpp介導的嚴謹反應，快速改變基因的表達，以適應營養(yǎng)環(huán)境的變化。已有研究發(fā)現(xiàn)一些細菌存在類似于真核HMGA(high-mobility group A)的全局調(diào)控蛋白CarD，在細菌參與營養(yǎng)脅迫和非生物脅迫反應調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。耐輻射異常球菌(Deinococcus radiodurans)具有對極端惡劣環(huán)境極強的適應能力，基因組序列分析顯示

2、該菌含有一個CarD蛋白。但是，耐輻射異常球菌CarD是否參與細胞生長和營養(yǎng)脅迫反應的調(diào)控，以及如何控制rRNA以及(p)ppGpp合成的作用機制尚不清楚。本研究通過構(gòu)建耐輻射異常球菌CarD突變株、表型分析、β-半乳糖苷酶活性測定、qRT-PCR、CHIP、蛋白質(zhì)組學等對CarD在營養(yǎng)等脅迫反應的調(diào)控進行了研究，取得如下結(jié)果:
　　1.CarD蛋白序列同源比較顯示異常球菌屬的CarD蛋白具有很高的相似性，在系統(tǒng)進化過程中來源于同

3、一個祖先。耐輻射異常球菌與已報道的其他屬細菌CarD相似性最高的是Thermusaquaticus，與粘細菌、分枝桿菌的CarD親緣關系較遠，屬于不同的進化分支。粘細菌CarD共316個氨基酸，與CarG蛋白形成全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控復合體，而分枝桿菌和耐輻射異常球菌沒有類似CarG的蛋白質(zhì)，而且CarD長度比較短，分別為162和169個氨基酸。分枝桿菌和耐輻射異常球菌的CarD蛋白相似性也很低(26％)。由此推測耐輻射異常球菌CarD與已報道的

4、粘細菌、分枝桿菌的CarD功能存在差異。
　　2.在營養(yǎng)脅迫條件下，carD基因的表達顯著增加（2倍以上），表明carD基因受營養(yǎng)饑餓誘導。為了研究耐輻射異常球菌CarD的功能，我們構(gòu)建了carD缺失突變株、回補株和過表達菌株，發(fā)現(xiàn)在正常條件和營養(yǎng)脅迫下，carD基因缺失均導致16S rRNA基因表達上調(diào)2倍以上;而relA基因在營養(yǎng)脅迫條件下表達顯著下調(diào)（2倍）。利用報告基因lacZ分析16S rRNA和relA基因啟動子活性的

5、結(jié)果表明CarD抑制16S rRNA合成、激活relA基因表達。CHIP實驗結(jié)果顯示CarD蛋白與16S rRNA和relA基因啟動子互作。為進一步研究CarD調(diào)控作用，我們構(gòu)建了過量表達菌株，發(fā)現(xiàn)16S rRNA基因的過量表達導致細胞在營養(yǎng)脅迫下生長速率下降，對熱脅迫敏感，UV輻射抗性增強，與carD缺失突變株的表型一致。此外，我們構(gòu)建了(p)ppGpp合成/水解酶缺失突變株，由于耐輻射異常球菌有2個與(p)ppGpp合成/水解酶相關

6、的基因（relA和relQ），通過對relA和relQ單、雙突變株及回補株的細胞生長分析發(fā)現(xiàn)relA和relQ缺失突變導致細菌對氨基酸饑餓、H2O2和熱脅迫敏感，與carD缺失突變株的表型一致。進一步分析發(fā)現(xiàn)relA和relQ雙突變菌株不能在限制性培養(yǎng)基中生長，而過量表達合成酶基因（relQ）或RelA合成保守結(jié)構(gòu)域片段（編碼RelA N'端HDc和RSD結(jié)構(gòu)域的DNA序列）導致細胞生長能力顯著下降。已有的研究表明(p)ppGpp作為信

7、號分子通過觸發(fā)細胞的嚴謹反應對生長速率進行調(diào)節(jié)，具有(p)ppGpp合成和水解酶活性雙功能的RelA在控制細胞內(nèi)(p)ppGpp含量發(fā)揮關鍵性作用。因此，在營養(yǎng)脅迫條件下，耐輻射異常球菌CarD通過激活relA基因表達，控制細胞內(nèi)(p)ppGpp的含量，抑制細胞生長。
　　3.研究結(jié)果表明耐輻射異常球菌CarD與至今研究最為深入的分枝桿菌和粘細菌的CarD之間具有類似的功能，同時存在一定差異。酵母雙雜實驗顯示耐輻射異常球菌CarD

8、與RAN聚合酶β'亞基互作，這與分枝桿菌的研究結(jié)果相符;粘細菌中CarD受藍光誘導，參與類胡蘿卜素的合成調(diào)控，而耐輻射異常球菌CarD受營養(yǎng)、氧化和UV脅迫誘導。并且，CarD除參與營養(yǎng)脅迫反應的調(diào)控外，還直接或間接地參與氧化、UV輻射等脅迫反應。CarD作為全局調(diào)控蛋白參與多重脅迫反應的作用機制還有待進一步研究。
　　綜上所述，耐輻射異常球菌CarD在逆境脅迫尤其是營養(yǎng)脅迫過程中通過負調(diào)控16S rRNA基因表達，或激活(p)p