極端耐輻射異常球菌Deinococcus radiodurans錯(cuò)配修復(fù)基因的功能鑒定和分析.pdf

1、本研究利用sacB/Sucs和rpoB/RifR突變分析系統(tǒng)，對(duì)預(yù)測(cè)的與錯(cuò)配修復(fù)相關(guān)的極端耐輻射異常球菌mutS基因(mutS1和mutS2)進(jìn)行了基因功能分析和鑒定。 研究利用Bacillussubtilis的sacB基因引入到D.radiodurans細(xì)胞，成功地建立了一種研究突變頻率和突變圖譜的sacB/蔗糖敏感(sacB/Sucs)突變分析系統(tǒng)。并首次應(yīng)用到極端耐輻射異常球菌D.radiodurans中，分析了該生物的

2、突變作用以及探討了mutS1和mutS2基因功能。借用條件致死基因sacB作為陽性選擇標(biāo)記，捕獲了四種D.radiodurans中可移動(dòng)插入序列(IS)元件：IS8031、IS2621、ISdrTCL2和ISdrTCL1。發(fā)現(xiàn)IS元件是細(xì)胞自發(fā)突變、誘發(fā)突變和導(dǎo)致基因失活的主要原因。對(duì)構(gòu)建的D.radioduransmutS1(DR1039)、mutS2(DR1976)及DR1975基因缺失突變株的突變頻率以及突變圖譜的分析表明，這些基

3、因的缺失提高了D.radiodurans的自發(fā)突變和輻射誘發(fā)突變頻率2-10倍，其中mutS2基因的缺失導(dǎo)致8kGy的γ輻射誘發(fā)突變頻率提高了近10倍，研究結(jié)果表明mutS1(DR1039)、mutS2(DR1976)及DR1975基因能有效地抑制IS元件的轉(zhuǎn)座活性，在維護(hù)D.radiodurans基因組的穩(wěn)定性起到重要作用。 為確定D.radiodurans這些基因在DNA錯(cuò)配修復(fù)途徑中的作用。利用來自分析Escherich

4、iacoli堿基替換的突變分析系統(tǒng)——rpoB/RifR突變分析系統(tǒng)，測(cè)定和分析了自發(fā)突變導(dǎo)致D.radioduransrpoB基因RifR的突變頻率和突變圖譜。研究結(jié)果表明D.radioduransmutS2基因不影響堿基替換(點(diǎn)突變)和9bp缺失引起的自發(fā)突變頻率，而mutS1和DR1975基因的缺失提高了rpoB基因RifR突變頻率2倍和8倍。突變圖譜分析表明mutS1基因的缺失導(dǎo)致突變熱點(diǎn)由野生型的一個(gè)熱點(diǎn)1259(T→G)改變

5、為三個(gè)(1435(G→A)、1319(C→A)和1441(A→C))；而DR1975基因的缺失增加另一個(gè)熱點(diǎn)1441(A→C)。用含有堿基替換和9bp的RifRrpoB基因片段進(jìn)行的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)表明mutS1基因的缺失提高了堿基替換rpoB基因片段轉(zhuǎn)化效率，高于轉(zhuǎn)化野生型菌株的3.5倍，轉(zhuǎn)化mutS2和DR1975基因缺失菌與野生型菌株的效率沒有區(qū)別，用9bp缺失突變的rpoB基因片段對(duì)所有測(cè)試菌株的轉(zhuǎn)化頻率沒有差異。研究結(jié)果證實(shí)mutS2