耐輻射異常球菌冷激反應(yīng)及冷激蛋白Csp介導(dǎo)的冷脅迫調(diào)控機制.pdf

1、低溫是細菌生存面臨的一種主要環(huán)境脅迫因素。細菌急性暴露于低溫環(huán)境時，為應(yīng)對這種變化細胞將產(chǎn)生一系列的級聯(lián)反應(yīng)，即冷激反應(yīng)。在冷激反應(yīng)中會大量誘導(dǎo)合成一類小分子蛋白質(zhì)家族統(tǒng)稱為冷激蛋白(cold shock proteins，Csps)。大量的實驗表明，冷激蛋白在適應(yīng)低溫脅迫和正常生長過程中都起到重要作用。耐輻射異常球菌（Deinococcus radiodurans）能生存于多種極端環(huán)境，但其冷脅迫的應(yīng)答反應(yīng)尚不清楚，特別是冷激蛋白Cs

2、p介導(dǎo)的調(diào)控機制報道甚少。本研究以耐輻射異常球菌作為研究對象，利用RNA-Seq技術(shù)測定正常和冷激條件下野生型菌株和csp突變株的轉(zhuǎn)錄組，并進一步用實時定量PCR驗證，測定其相關(guān)生理生化表型，探討了Csp的作用機制，取得如下結(jié)果:
　　1.Western Blot結(jié)果顯示，Csp在冷激4h后開始大量積累，具備冷激反應(yīng)的基本特征。為了揭示耐輻射異常球菌冷激反應(yīng)的過程，開展了該菌在正常條件和冷脅迫條件下(15℃，4h)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)測定，

3、分析結(jié)果表明，冷脅迫導(dǎo)致199個基因表達上調(diào)，642個基因表達下調(diào)，其中包括了低溫信號感應(yīng)，傳遞和應(yīng)答的過程所涉及的代謝通路。其冷激反應(yīng)的基本特征如下:1）DNA旋轉(zhuǎn)酶基因gryB上調(diào)了2.1倍，UvrABC途徑相關(guān)基因均上調(diào)1.8倍以上，有效防止低溫對細胞核酸結(jié)構(gòu)的破壞;2）過氧化氫酶基因katA上調(diào)了16倍，防止低溫產(chǎn)生的氧自由基對蛋白造成的損傷;3）細胞膜S層結(jié)構(gòu)基因均上調(diào)2倍以上，幫助維持低溫下細胞膜的結(jié)構(gòu)。根據(jù)以上結(jié)果，繪制了

4、耐輻射異常球菌冷激反應(yīng)調(diào)節(jié)圖。研究表明，大腸桿菌冷激反應(yīng)增強DNA修復(fù)及滲透保護物質(zhì)轉(zhuǎn)運的能力，耐輻射異常球菌除這些特征外，還在抗氧化和細胞膜保護等方面進行了應(yīng)答。
　　2.序列分析表明，耐輻射異常球菌基因組中只含有1個冷激蛋白同源的基因，被命名為csp。同源比對和三維建模證明，Csp具有冷激蛋白家族典型的核酸結(jié)合域，可能對其他代謝途徑進行調(diào)控。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，csp冷激前后均處于高表達狀態(tài)，為了研究csp在該菌中的功能，我們構(gòu)建

5、了csp基因的突變株△csp和回補株△cspC，發(fā)現(xiàn)在15℃C冷脅迫下突變株△csp生長停止，野生型和回補株△cspC可以緩慢生長。正常溫度下表型分析發(fā)現(xiàn):1）突變株△csp生長慢于野生型和回補株△cspC，可見csp的缺失影響細胞的生長速度;2）△csp對過氧化氫敏感。上述研究表明，Csp在耐輻射異常球菌低溫生存中發(fā)揮重要作用，同時還參與正常條件下多個代謝途徑的調(diào)控。
　　3.為進一步探究Csp的調(diào)節(jié)機制，開展了冷脅迫下野生型和

6、突變株△csp的轉(zhuǎn)錄組研究，結(jié)合相關(guān)基因的啟動子分析:促旋酶基因（gyrB），過氧化氫酶基因（katA）和麥芽糖轉(zhuǎn)運基因(malE)的啟動子區(qū)都含有Csp偏好結(jié)合的序列，推測Csp可能通過結(jié)合這些基因的啟動子對它們進行調(diào)控。實時定量PCR結(jié)果表明，在低溫下katA和katE基因表達量分別提高了2.2倍和3倍。低溫下過氧化氫酶活性為正常條件的1.6倍，而在△csp中卻受到抑制。推測低溫誘導(dǎo)的冷激蛋白Csp可以提高過氧化氫酶活性，有效的清除