pprM及其DNA結(jié)合域基因敲除對耐輻射奇球菌輻射抗性影響.pdf

1、目的
　　耐輻射奇球菌（Deinococcus Radiodurans，DR）對于電離輻照及多種極端環(huán)境具有極強的抗性，有研究提示pprM基因可能對DR菌的極強輻射抗性具有重要作用。本研究擬構(gòu)建 pprM及其 DNA結(jié)合域敲除株 DR1△pprM和DR1pprM△CSD，并分析其基因敲除株在極端環(huán)境條件下的抗性變化，綜合探討pprM及其DNA結(jié)合功能在DR菌的輻射抗性中所起的作用。
　　方法
　　1.運用生物信息學(xué)方法

2、對pprM基因、pprM基因DNA結(jié)合域及其對應(yīng)蛋白產(chǎn)物PprM的理化性質(zhì)、高級結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能等進行分析與預(yù)測；
　　2.利用體外overlap PCR連接、體內(nèi)同源重組的方法對DR pprM基因、pprM基因DNA結(jié)合域進行基因敲除，紫外輻照、絲裂霉素C（MMC）和H2O2處理后對DR野生株和pprM及其DNA結(jié)合域基因敲除株的生存率等進行分析。初步研究pprM基因DNA結(jié)合域在DR菌體內(nèi)的生物學(xué)功能。
　　結(jié)果

3、　　1.生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示， PprM編碼蛋白是一種含有 Cold-Shock DNA-binding domain（冷休克DNA結(jié)合域）的DNA結(jié)合蛋白。進一步的pprM基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)pprM是cspA基因的同源基因，CspA蛋白可作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子通過結(jié)合于其他DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因的啟動子區(qū)域調(diào)控其表達。
　　2.以耐輻射奇球菌基因組DNA為模板，通過普通PCR方法獲得pprM基因及其DNA結(jié)合域3’端片段片段及5’端片

4、段，以PCR產(chǎn)物為模板通過overlap PCR的方法獲得pprM基因缺失的DNA片段△pprM，同理可獲得pprM DNA結(jié)合域缺失的DNA片段 pprM△CSD，將獲得的目的片段與基因敲除載體pk18mobsacB連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 JM109感受態(tài)，提取質(zhì)粒，酶切鑒定，進一步測序鑒定分析，結(jié)果顯示基因敲除重組載體 pk18mobsacB-△pprM和pk18mobsacB-pprM△CSD構(gòu)建成功。將重組載體電轉(zhuǎn)化DR菌感受態(tài)，兩

5、次篩選得到pprM基因及其DNA結(jié)合域敲除株。pprM及其DNA結(jié)合域基因敲除株生長速度變緩。紫外輻照、絲裂霉素C處理后，結(jié)果顯示pprM DNA結(jié)合域敲除株與pprM基因敲除株類似，與DR野生株相比前兩者生存率均下降。H2O2處理結(jié)果發(fā)現(xiàn)， pprM及其DNA結(jié)合域基因敲除對DR氧化抗性影響相對較小。結(jié)論
　　1.生物信息學(xué)分析顯示pprM含有Cold-Shock DNA-binding domain（冷休克DNA結(jié)合域），推測