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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
心腦血管疾病已成為威脅人類健康的頭號(hào)殺手,動(dòng)脈粥樣硬化則是其重要的致病因素之一。目前認(rèn)為,動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展的主要原因是脂質(zhì)代謝紊亂和炎癥反應(yīng),雖然它們各自都是動(dòng)脈粥樣硬化獨(dú)立的危險(xiǎn)因素,但越來越多的研究表明,二者在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中是相互影響和相互促進(jìn)的。
內(nèi)皮脂肪酶是近年來新發(fā)現(xiàn)的甘油三酯脂酶家族的成員,在脂代謝過程中發(fā)揮著重要作用。內(nèi)皮脂肪酶主要具有磷脂酶活性,是高密度脂蛋白代謝的關(guān)鍵酶,
2、其主要由內(nèi)皮細(xì)胞分泌產(chǎn)生,肝細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞等也可有少量分泌。高密度脂蛋白是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中的保護(hù)性因素,因而抑制EL的活性或減少EL的表達(dá),可能在一定程度上抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。EL的表達(dá)調(diào)控受多種因素影響,炎癥、血壓及血管剪切力等都可影響EL的表達(dá);此外,ANGPTL3是由肝臟分泌產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子,在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用。相關(guān)研究表明其可能是內(nèi)源性的EL抑制劑。由于炎癥是動(dòng)脈粥樣硬化重要的致病因素之一。因此,進(jìn)一
3、步明確炎癥調(diào)控內(nèi)皮脂肪酶在體內(nèi)表達(dá)的機(jī)制,則可能為我們?cè)谥|(zhì)代謝紊亂和炎癥反應(yīng)之間構(gòu)建一個(gè)新的橋梁,進(jìn)而為動(dòng)脈粥樣硬化的研究和干預(yù)提供新的思路。
脂多糖(LPS)是重要的炎癥反應(yīng)的刺激物,它可以選擇性的作用于細(xì)胞表面的Toll樣受體4(TLR-4),從而激活細(xì)胞內(nèi)的炎癥反應(yīng)信號(hào)通路,例如NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等,研究已表明LPS可促進(jìn)動(dòng)物及人類的動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路都是炎
4、癥反應(yīng)時(shí)細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)。研究表明,其可能是各種危險(xiǎn)因素導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制之一。PDTC是一種金屬離子螯合劑,其可以競(jìng)爭(zhēng)性抑制IκBα的釋放,進(jìn)而抑制NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路的激活。SB203580可以選擇性的抑制p38MAPK的激活,而對(duì)于JNK/SAPK和p44/42MAPK(即Erk1/2)無顯著作用。本課題以野生型C57BL/6小鼠和ApoE-/-小鼠為研究對(duì)象,通過腹腔注射脂多糖作為慢性炎癥刺激,觀察在體內(nèi)炎癥環(huán)境下
5、脂多糖對(duì)小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮脂肪酶(EL)、NF-κB p65、p38MAPK及磷酸化的p38MAPK的表達(dá)影響,同時(shí)觀察他汀類藥物(阿托伐他汀鈣)對(duì)該效應(yīng)的抑制作用。此外通過腹腔注射NF-κB信號(hào)通路阻斷劑PDTC和p38MAPK信號(hào)通路阻斷劑SB203580進(jìn)一步驗(yàn)證脂多糖是否通過NF-κB和p38MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)小鼠主動(dòng)脈內(nèi)EL的表達(dá)。
方法:
2.1動(dòng)物模型的建立
選取8周齡野生型雄性C57BL/
6、6小鼠共40只,8周齡雄性ApoE-/-小鼠共8只,適應(yīng)性普食喂養(yǎng)一周后,改為高脂飲食(15%黃油,0.25%膽固醇)喂養(yǎng)。
實(shí)驗(yàn)分組共分為六組,每組8只,包括:①LPS(C57BL/6)組:腹腔注射LPS(2mg/kg),每周三次,持續(xù)12周;②LPS(ApoE-/-)組:同樣給予腹腔注射LPS(2mg/kg),每周三次,持續(xù)12周;③阿托伐他汀鈣組:腹腔注射LPS(2mg/kg),同時(shí)給予阿托伐他汀鈣懸液灌胃(20mg/k
7、g/d),持續(xù)12周;④正常對(duì)照組:腹腔注射生理鹽水(2mg/kg),每周三次,持續(xù)12周;⑤PDTC組:腹腔注射LPS(2mg/kg),同時(shí)給予PDTC(20mg/kg/d)腹腔注射,持續(xù)12周;⑥SB203580組:腹腔注射LPS(2mg/kg),同時(shí)給予SB203580(5ug/kg/d)腹腔注射,持續(xù)12周。在藥物干預(yù)的12周末,對(duì)各組小鼠進(jìn)行安樂死。
2.2血脂測(cè)定
前4組(LPS(C57BL/6)組,LP
8、S(ApoE-/-)組,阿托伐他汀鈣組,正常對(duì)照組)小鼠處死前,空腹經(jīng)心臟采血,收集血清,檢測(cè)甘油三酯(TG),總膽固醇(TC),低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C),高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。
2.3血清TNF-α、IL-1β和ANGPTL3測(cè)定
通過酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA),用試劑盒對(duì)采集的前4組小鼠(同上)的血清進(jìn)行TNF-α、IL-1β和ANGPTL3的含量測(cè)定。
2.4HE染色和免疫組化
9、
ApoE-/-組小鼠和正常對(duì)照組小鼠在藥物干預(yù)12周后取材。取主動(dòng)脈弓部至降主動(dòng)脈長(zhǎng)約1-1.5cm的組織,脫水后石蠟包埋,5um切片行HE染色。應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)ApoE-/-小鼠和正常對(duì)照組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)EL的表達(dá),Image-Pro Plus5.0圖像分析軟件計(jì)算陽(yáng)性面積占動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積百分比。
2.5Western Blot
取前4組小鼠(同上)主動(dòng)脈弓部至降主動(dòng)脈長(zhǎng)約1-1.5cm的組織,
10、用加入了磷酸酶抑制劑的蛋白裂解液裂解組織提取總蛋白,然后用BCA法測(cè)定蛋白濃度。電泳轉(zhuǎn)膜,封閉,孵育一抗、二抗、發(fā)光,測(cè)量主動(dòng)脈內(nèi)EL、NF-κB p65、p38MAPK以及p-p38MAPK的相對(duì)含量。
2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(MEAN±SD)表示,兩兩比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn),多個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間的比較采用單因素方差分析(ANOVA)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPrism5統(tǒng)計(jì)軟件。P<0.05,差異有統(tǒng)
11、計(jì)學(xué)差異。
結(jié)果:
3.1LPS(C57BL/6)組和LPS(ApoE-/-)組小鼠血清中總膽固醇表達(dá)水平較正常對(duì)照組明顯升高,p<0.05; LPS(C57BL/6)組和LPS(ApoE-/-)組小鼠血清中高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)表達(dá)水平較正常對(duì)照組明顯降低,p<0.05。阿托伐他汀鈣組小鼠血清總膽固醇表達(dá)水平較LPS(C57BL/6)組明顯降低,而血清高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)表達(dá)水平,較LPS(C
12、57BL/6)組小鼠明顯增加,均p<0.05。
3.2LPS(C57BL/6)組和LPS(ApoE-/-)組小鼠血清中TNF-α和IL-1β表達(dá)量較正常對(duì)照組均明顯增加,均p<0.05。阿托伐他汀鈣組小鼠血清TNF-α和IL-1β表達(dá)量則較LPS(C57BL/6)組小鼠明顯降低,均p<0.05。
3.3LPS(C57BL/6)組和LPS(ApoE-/-)組小鼠血清中ANGPTL3的表達(dá)量較正常對(duì)照組明顯降低,均p<0
13、.05。阿托伐他汀鈣組小鼠血清ANGPTL3表達(dá)量則較LPS(C57BL/6)組小鼠明顯增加,p<0.05。
3.4LPS(C57BL/6)組和LPS(ApoE-/-)組小鼠EL的表達(dá)量較正常對(duì)照組明顯增加,均p<0.05。阿托伐他汀鈣組主動(dòng)脈EL的表達(dá)量與單純接受LPS刺激的C57BL/6小鼠相比明顯減少,p<0.05。
3.5LPS(C57BL/6)組小鼠和LPS(ApoE-/-)組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)NF-κ B p6
14、5和p-p38MAPK蛋白表達(dá)量較正常對(duì)照組明顯增加,均p<0.05;阿托伐他汀鈣組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)p-p38MAPK蛋白表達(dá)量與單純接受LPS刺激的C57BL/6小鼠相比明顯減少,均p<0.05,而NF-κB p65蛋白表達(dá)量變化則不顯著。
3.6野生型C57BL/6小鼠在腹腔注射LPS的同時(shí),腹腔注射PDTC,主動(dòng)脈EL的表達(dá)量與單純接受LPS刺激的C57BL/6小鼠相比明顯減少,p<0.05。
3.7野生型C57B
15、L/6小鼠在腹腔注射LPS的同時(shí),腹腔注射SB203580,主動(dòng)脈EL的表達(dá)量與單純接受LPS刺激的C57BL/6小鼠相比明顯減少,p<0.05。
3.8H&E染色結(jié)果顯示正常對(duì)照組小鼠主動(dòng)脈弓部?jī)?nèi)膜光滑,無明顯增厚,內(nèi)皮細(xì)胞排列整齊。ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈弓部?jī)?nèi)膜和中膜則有明顯的動(dòng)脈粥樣硬化表現(xiàn),可見多發(fā)的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成。免疫組化結(jié)果顯示,正常對(duì)照組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)幾乎沒有EL的表達(dá),而ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜,尤其
16、是斑塊內(nèi),則可見明顯的EL的表達(dá)。
結(jié)論:
1.LPS可以增加炎癥因子TNF-α和IL-1β的表達(dá),并可能通過這種慢性炎癥反應(yīng)促進(jìn)野生型C57BL/6小鼠和ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮脂肪酶的表達(dá)。
2.LPS可能通過抑制ANGPTL3的表達(dá)促進(jìn)小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮脂肪酶的表達(dá)。
3.LPS促進(jìn)小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮脂肪酶表達(dá)的效應(yīng)可能部分通過激活NF-κB和p38MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑實(shí)現(xiàn)。
4.阿托
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