去勢對小鼠主動脈衰老的影響及生理劑量睪酮的干預(yù)研究.pdf

1、衰老是生命過程中整個集體形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能逐漸衰退現(xiàn)象的總稱,是生命過程的必然規(guī)律,不可抗拒。按照聯(lián)合國劃分標(biāo)準來看,當(dāng)一個社會65歲以上老年人占總?cè)丝?％以上時,稱之為老年型。據(jù)第五次人口普查統(tǒng)計顯示,2000年,中國65歲以上老人達8883.44萬,占人口結(jié)構(gòu)比重為6.8％,與世界平均水平一致,2005年全國1％人口抽樣調(diào)查顯示,65歲及以上的人口為10045萬人,占總?cè)丝诘?.69％,而至2009年,中國的老齡化比例已達8.3％,顯

2、著趕超世界平均水平7.5％。由此看出,中國已經(jīng)進入了老齡化社會,且中國人口變化的另一個顯著特點是有“未富先老”的趨勢。隨著經(jīng)濟的發(fā)展,提高人群的生活質(zhì)量,延緩衰老成為社會關(guān)注的焦點。而衰老相關(guān)疾病中,老年人心血管疾病是一個不容忽視的問題。
　　 衰老一直是生命科學(xué)領(lǐng)域最基本和最神秘的研究之一,隨著衰老研究及分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展,衰老機制的研究已經(jīng)從細胞水平、亞細胞水平逐漸走向分子與基因水平,現(xiàn)已有研究表明,衰老是一個由基因調(diào)節(jié)的

3、過程,是預(yù)先設(shè)定的,當(dāng)前比較肯定的如klotho基因等抗衰老基因,但衰老也受環(huán)境因素以及生活方式的影響。據(jù)統(tǒng)計,目前比較認可的衰老的機制還包括如自由基損傷說、生物膜損傷學(xué)說、端?？s短學(xué)說、線粒體DNA損傷學(xué)說、代謝產(chǎn)物交聯(lián)說、體細胞突變說、差錯積累說、免疫紊亂說等等,有自由基學(xué)說、線粒體DNA損傷學(xué)說、端粒學(xué)說、生物膜損傷學(xué)說、遺傳程序?qū)W說、染色體突變學(xué)說、差錯學(xué)說、免疫學(xué)說、內(nèi)分泌學(xué)說等。以及在2000年由Franceschi等首次提

4、出的炎性衰老。總體來講上述這些學(xué)說上可分為兩大類:即一類為以ROS、糖基化、激素紊亂等損害為代表的環(huán)境傷害衰老理論,另一類是以端?？s短、細胞周期調(diào)控因子等為代表的遺傳因子程序化衰老理論,前者認為衰老是環(huán)境因素對細胞進行性和累積性毀壞的結(jié)果；后者認為衰老是機體有序的基因活動,是通過遺傳按程序預(yù)先安排好的,或為特異的“衰老”基因所表達,或為可用基因的最終耗竭。各種不同的學(xué)說均對衰老機制進行了深入的探討,且走上了將上述理論相融合的時代,即將研

5、究集中在環(huán)境因子傷害造成的衰老的遺傳程序改變的相關(guān)范圍之內(nèi)。
　　 隨著年齡的增長,血管壁部分細胞衰老,其內(nèi)皮細胞會發(fā)生形態(tài)與功能的改變,具體為細胞肥大扁平,內(nèi)源性一氧化氮分泌減少,呈現(xiàn)出促炎與促栓的表型,其結(jié)構(gòu)也會發(fā)生重大變化,包括血管僵硬度增加,血管壁增厚,血管腔擴大,以及血管舒張功能減弱,這些變化改變了各種心腦血管疾病的病理生理機制,這可能是多種增齡相關(guān)性疾病,包括主動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)形成

6、的共同機制之一。
　　 睪酮是一種類固醇激素,男性體內(nèi)主要的雄激素,屬于一種合成激素,也是一種激素原。有研究表明,隨著年齡的增長,男性50歲后體內(nèi)總睪酮及生物活性睪酮水平逐漸出現(xiàn)明顯下降。多項國內(nèi)外研究表明性激素失衡是引起衰老的重要因素之一,因為睪酮有改善老年人的認知能力、調(diào)整人體脂肪肌肉的比例,增加肌肉力量,改善運動能力,減少胰島素抵抗,抑制血脂異常增加,改善性功能的作用等,故睪酮是否可以延緩衰老值得進一步研究。研究表明老年男

7、性血漿睪酮水平與多種增齡相關(guān)性疾病發(fā)病率相關(guān),即在一定范圍內(nèi),隨著睪酮水平下降,增齡性疾病的發(fā)病率上升。研究表明,一定濃度的睪酮可通過減弱VCAM-1等多個途徑來抗動脈粥樣硬化的作用,雄激素還具有改善認知能力、炎癥反應(yīng)、抗凋亡作用、抗氧化系統(tǒng)等作用。我們的上一個課題中研究表明,睪酮在體外干預(yù)血管內(nèi)皮細胞可抑制過氧化氫誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞衰老,也系統(tǒng)證明了性激素失衡參與和誘發(fā)了衰老的發(fā)生與發(fā)展,適當(dāng)調(diào)節(jié)性激素平衡有助于延緩衰老。但睪酮能否改善或

8、延緩主動脈衰老進程,尚需進一步研究。為明確睪酮在干預(yù)主動脈衰老進程中的作用,期望其能為增齡相關(guān)脈管系統(tǒng)疾病的防治提供新的靶點。
　　 本研究以目前公認的衰老標(biāo)志物:(1)小鼠主動脈組織中的超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)以及丙二醛(Maleic Dialdehyde,MDA)的含量。(2)小鼠主動脈線粒體DNA(mtDNA)缺失突變的突變率。從機體能量代謝的線粒體著手,從DNA分子水平來探討抗衰

9、老的方法,具有重要的意義。(3)其組織中去磷酸化Rb蛋白表達的量旨在探討生理劑量的外源性睪酮對去勢小鼠主動脈衰老進程的影響。
　　 方法:
　　 1.實驗動物及分組32只C57BL/6J雄性小鼠,其中24只為8周齡,隨機取16只去勢,另取8只為18月齡自然衰老C57BL/6J雄小鼠。分組如下:正常組(n=8),去勢組(n=8),去勢+生理劑量的丙酸睪酮(T)組(n=8),自然衰老組(n=8)。
　　 2.制作去勢

10、小鼠模型:隨機選取16只8周齡的C57BL/J6J小鼠切除睪丸并縫合陰囊。
　　 3.血清睪酮濃度的檢測:用ELISA試劑盒檢測雄性小鼠血清睪酮水平。
　　 4.MDA及SOD濃度的檢測:MDA采用硫代巴比妥酸法,SOD采用Oyanagui的亞硝酸鹽形成法。嚴格按試劑盒說明書操作。
　　 5.各組小鼠主動脈線粒體DNA缺失突變的突變率檢測:
　　 提取線粒體DNA,嚴格按申能博彩公司全基因組DNA提取試劑

11、盒說明書提取基因組DNA。巢氏PCR以及普通PCR引物設(shè)計及合成,巢氏PCR以及普通PCR擴增相應(yīng)主動脈mtDNA片段。瓊脂糖電泳鑒定PCR產(chǎn)物以及凝膠分析系統(tǒng)掃描結(jié)果并分析突變率。純化PCR產(chǎn)物并送鑒定。
　　 6.Westem-blot法檢測磷酸化Rb蛋白表達:提取小鼠主動脈組織的組織總蛋白,BCA測量蛋白濃度。
　　 7.統(tǒng)計學(xué)處理所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準差((x)±s)來表示,應(yīng)用spss13.0標(biāo)準統(tǒng)計軟件,各組

12、間采用單因素方差分析(One—Way ANOVA),線性關(guān)聯(lián)性分析采用線性趨勢檢驗。p<0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.各組小鼠血清睪酮水平與正常組相比較,去勢組與自然衰老組小鼠血清睪酮水平均顯著降低(P=0.000),且正常組與去勢+生理量睪酮組之間、去勢組與自然衰老組之間無統(tǒng)計學(xué)差異,注射外源性睪酮后,去勢小鼠血清睪酮水平均恢復(fù)到正常水平。
　　 2.各組小鼠主動脈組織MDA含量、SOD活

13、性的比較與正常組小鼠比較,衰老組、去勢組主動脈組織中MDA含量升高,SOD活性降低(P均為0.000)；而給予生理劑量的睪酮3個月后,MDA含量、SOD活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與衰老組比較,去勢+T組小鼠主動脈組織中MDA含量降低,SOD活性增高(P均為0.000)；去勢組主動脈組織中MDA含量以及SOD活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P分別為0.575和0.226)。
　　 3.PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果四組C57 BL

14、/6J小鼠主動脈線粒體DNA均擴增出4549bp的未突變條帶,也均可見916bp、851bp的缺失片段。自然衰老組及去勢組可見476bp片段和304bp,去勢+T組尚可見304bp。與正常組小鼠主動脈mtDNA突變率相比,去勢組與自然衰老組突變率明顯增加(P=0.000),且正常組與去勢+T組、自然衰老組與去勢組之間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義,其P值分別為0.220、0.221。即補充外源性丙酸睪酮后,去勢小鼠主動脈mtDNA突變率明顯降低(

15、P=0.000)。其中睪酮濃度與小鼠主動脈mtDNA缺失突變率相關(guān)系數(shù)為0.720。PCR產(chǎn)物測序結(jié)果,用巢氏PCR第二輪所用到的引物F3、F4用于檢測缺失型mtDNA片段的序列,該過程是由上海英駿生物工程有限公司(廣州分公司)檢測,證明衰老和去勢小鼠存在3713、3864、4236、4415的缺失突變,其共同特點是前后均有各自相似的兩段序列。
　　 4.各組小鼠主動脈組織去磷酸化Rb蛋白表達比較與正常組小鼠比較,去勢組小鼠心肌

16、組織去磷酸化Rb蛋白表達量增加(P=0.001)；給予生理劑量睪酮干預(yù)3個月后主動脈組織去磷酸化Rb蛋白表達量較去勢組減少(P=0.001),與正常組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.873)；自然衰老組小鼠心肌組織去磷酸化Rb蛋白表達量增加(P=0.000)。與自然衰老組小鼠相比,去勢組小鼠主動脈組織去磷酸化Rb蛋白表達量無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.410),去勢+T組去磷酸化Rb蛋白表達量減少(P=0.000)。
　　 結(jié)論: