人類胚胎干細胞富集的蛋白-蛋白和功能相互作用網(wǎng)絡(luò).pdf

1、隨著后基因組時代的到來，高通量研究技術(shù)取得了巨大發(fā)展，如基因芯片技術(shù)，蛋白芯片技術(shù)等，因此生命科學(xué)研究形式也開始發(fā)生轉(zhuǎn)變，如由過去一味強調(diào)單基因、蛋白的研究開始轉(zhuǎn)向研究整個相互作用組。目前，生物醫(yī)學(xué)知識常常可以采用網(wǎng)絡(luò)形式來代表，如調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)、代謝網(wǎng)絡(luò)、基因相互作用網(wǎng)絡(luò)、蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)、小分子相互作用網(wǎng)絡(luò)等。構(gòu)建和分析這些網(wǎng)絡(luò)揭示了許多以前未知的知識。在人類胚胎干細胞研究中，網(wǎng)絡(luò)知識也得到廣泛的應(yīng)用，但大多研究強調(diào)轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究，在此

2、種網(wǎng)絡(luò)研究中，主要探討轉(zhuǎn)錄因子的重要性，這些研究發(fā)現(xiàn)了一些在人類胚胎干細胞特性調(diào)節(jié)中許多重要的轉(zhuǎn)錄因子，最近，基于蛋白-蛋白相互作用的網(wǎng)絡(luò)生物信息學(xué)研究取得了較大成功。 芯片技術(shù)提供了一個用于同時研究一個細胞或組織全基因組表達的較好平臺。在胚胎干細胞基因表達研究中，許多實驗室采用芯片技術(shù)，但由于各種原因，如芯片平臺差異、細胞株差異、實驗操作技術(shù)差異等，人類胚胎干細胞基因表達譜存在較大的異質(zhì)性。最近采用統(tǒng)合分析方法分析基因表達譜芯

3、片增加了結(jié)果的可靠性。Assou等采用此方法得到了一組“人類胚胎干細胞一致基因集”。在此基因集中的一些基因同時也在人體其他少數(shù)組織細胞中表達，說明一些蛋白單個形式表達可能不是特異性存在于胚胎干細胞，但是整個聯(lián)合蛋白集的表達形式是胚胎干細胞特異的，這暗示它們之間的相互作用可能是特異性的。 復(fù)雜網(wǎng)路無標度特性的提出，突破了隨機網(wǎng)絡(luò)模型的束縛，使大家認識到各種復(fù)雜系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，都遵從某些基本法則。隨后幾年，全世界范圍內(nèi)興起了研究復(fù)雜

4、網(wǎng)絡(luò)的熱潮。復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)理論以社會網(wǎng)絡(luò)、技術(shù)網(wǎng)絡(luò)、生物網(wǎng)絡(luò)等真實網(wǎng)絡(luò)為研究對象，通過圖論等方法，研究網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)特征、結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系等一系列問題，從而來獲得對于現(xiàn)實系統(tǒng)更多認識。復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)理論作為一門新興學(xué)科，為在系統(tǒng)水平上研究生物網(wǎng)絡(luò)提供了新的理論依據(jù)和平臺。2000年Jeong等人在Nature上第一次發(fā)表利用復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)理論研究代謝網(wǎng)絡(luò)拓撲特性的論文，自此以后，利用復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)理論研究各種生物網(wǎng)絡(luò)迅速發(fā)展。復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)理論揭示，細胞內(nèi)分子相互作用網(wǎng)絡(luò)

5、的結(jié)構(gòu)特性，與其它復(fù)雜系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)（如萬維網(wǎng)、社會網(wǎng)）在很大程度上是一致的，說明可能存在相似的法則控制著多數(shù)現(xiàn)實中的生物復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。 根據(jù)以上研究，我們提出兩個問題：（1）是否存在胚胎干細胞富集的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)？如果有，此網(wǎng)絡(luò)的拓撲結(jié)構(gòu)特征怎樣？（2）是否存在胚胎干細胞富集的功能相互作用方式，調(diào)節(jié)胚胎干細胞特性？我們采用基于復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)理論的生物信息學(xué)方法來解釋以上問題。 研究內(nèi)容主要分為三個部分： 第一部分：構(gòu)建人

6、類胚胎干細胞富集的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，并探討網(wǎng)絡(luò)拓撲特征。收集已有研究報道采用統(tǒng)合分析得到的一組“人類胚胎干細胞一致基因集”，通過在線Uniprot ID軟件進行名稱轉(zhuǎn)換，得到1020個UniprotKb/SwissProt蛋白號，即胚胎干細胞相關(guān)蛋白。同時下載人類蛋白相互作用數(shù)據(jù)庫I2d，經(jīng)自編perl程序?qū)?shù)據(jù)庫進行整理，刪除數(shù)據(jù)庫中冗余的蛋白相互作用對，得到13560個SwissProt蛋白及其組成的92545個非冗余蛋白相互作用對

7、。收集了課題組梁爽教授研究報道97個正常人類組織中選擇性表達的基因Affymetrix探針號，通過Affymetrix公司提供的最新注解文件對探針號進行重新注解，最終獲得3904個組織選擇性編碼蛋白基因。對比干細胞一致性基因集和組織選擇性基因，發(fā)現(xiàn)有274交叉基因。利于自編perl程序?qū)ふ矣膳咛ジ杉毎嚓P(guān)蛋白組成的蛋白相互作用對，通過廣度優(yōu)先算法搜索I2d蛋白相互作用數(shù)據(jù)庫，得到由403個胚胎干細胞相關(guān)蛋白組成的連續(xù)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。并

8、進行1000次隨機抽樣網(wǎng)絡(luò)，統(tǒng)計分析表明明顯小于此干細胞網(wǎng)絡(luò)，我們將之命名為干細胞富集蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，通過Cytoscape軟件對此網(wǎng)絡(luò)進行可視化分析。根據(jù)復(fù)雜無標度網(wǎng)絡(luò)Barabasi-Albert模型，分析構(gòu)建的干細胞富集蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點度及其相關(guān)度分布，最終得到網(wǎng)絡(luò)度相關(guān)冪律指數(shù)γ值為1．3081，證明此網(wǎng)絡(luò)和真實網(wǎng)絡(luò)類似，具有無標度特性。 第二部分：根據(jù)復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)理論，重點對網(wǎng)絡(luò)中心蛋白進行分析。由于干細胞富集蛋

9、白相互作用網(wǎng)絡(luò)具有無標度特性，我們采用自編perl程序，利用Dijkstra算法對不同刪除方法刪除網(wǎng)絡(luò)一定節(jié)點后，計算網(wǎng)絡(luò)平均最短路徑長度變化，探討網(wǎng)絡(luò)是否具有魯棒性和脆弱性特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當刪除網(wǎng)絡(luò)0、4、8、12、16、20個隨機節(jié)點后，網(wǎng)絡(luò)的平均最短路徑長度分別為：3．679、3．676±0．006、3．674±0．016、3．672±0．016、3．686±0．052、3．688±0．040。經(jīng)統(tǒng)計證明刪除不同數(shù)量節(jié)點后與未刪除節(jié)

10、點的平均最短路徑長度未發(fā)生明顯改變。當刪除網(wǎng)絡(luò)0、4、8、12、16、20個中心節(jié)點后，網(wǎng)絡(luò)平均最短路徑長度分別為3．679、3．770±0．055、3．849±0．065、4．028±0．020、4．208±0．118、4．448±0．092。經(jīng)統(tǒng)計證明刪除不同中心節(jié)點與未刪除節(jié)點比較，平均最短路徑長度發(fā)生了明顯改變，而且隨著刪除中心節(jié)點數(shù)目增加，平均最短路徑長度隨之增加。以上證明我們構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)具有較強的魯棒性和脆弱性，說明網(wǎng)絡(luò)中心蛋

11、白（節(jié)點）對網(wǎng)絡(luò)的拓撲結(jié)構(gòu)穩(wěn)定具有重要作用。采用5%最高連接數(shù)標準定義中心蛋白，我們共發(fā)現(xiàn)21個中心蛋白，分別為：MYC、EIF4A1、DDX18、H2AFX、KIAA0020、RPL4、PCNA、POLR1B、HSPA8、DKC1、CDC2、EIF4E、BXDC1、BOP1、RPLP0、EIF3A、RUVBL1、HDAC2、GFPT2、HISTIH4C、CBS。通過文獻搜索，我們發(fā)現(xiàn)中心蛋白中MYC、H2AFX、RUVBL1已有報導(dǎo)與

12、干細胞自我更新，增殖等特性密切相關(guān)。另外通過MGI數(shù)據(jù)庫資料發(fā)現(xiàn)POLRIB、CDC2、HDAC2、MYC與胚胎發(fā)育密切相關(guān)，突變將導(dǎo)致胚胎致死，結(jié)合上述網(wǎng)絡(luò)研究結(jié)果，我們推測：中心蛋白對胚胎干細胞特征維持具有重要意義。通過Gather和TFM-Explore兩個軟件預(yù)測中心蛋白編碼基因-1200到+200啟動子序列的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，我們發(fā)現(xiàn)一個新的轉(zhuǎn)錄因子NF-Y能調(diào)控9個中心蛋白編碼基因。結(jié)合已報道的SOX2，OCT-4，NANO

13、G，c-Myc重要轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控靶基因集和I2d蛋白相互作用數(shù)據(jù)庫，我們構(gòu)建了胚胎干細胞重要轉(zhuǎn)錄因子與中心蛋白關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，我們提出一個新的假說：SOX2，OCT-4，NANOG等重要轉(zhuǎn)錄因子通過自身調(diào)控和相互間調(diào)控的回路，從而維持了在胚胎干細胞中合適表達水平，它們進一步通過調(diào)控許多重要的中心蛋白編碼基因，從而維持了胚胎干細胞相互作用網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，發(fā)揮對胚胎干細胞的調(diào)節(jié)作用。 第三部分：構(gòu)建人類胚胎干細胞富集的功能相互作用網(wǎng)絡(luò)。

14、為了鑒定人類胚胎干細胞中富集的功能相互作用方式，我們利用QuickGO軟件對人類I2d數(shù)據(jù)庫中13560蛋白進行了基因本體分子功能GOSlim注解，結(jié)果表明在13560個蛋白中，目前具有一個及以上的GOSlim分子功能注解蛋白為9881個。進一步采用我們編寫的perl程序分別將人類胚胎干細胞富集蛋白相互作用對和I2d蛋白相互作用對注解成相對應(yīng)的分子功能GOSlim-GOSlim相互作用對，結(jié)果：在I2d數(shù)據(jù)庫中的92545對蛋白相互作用

15、對中，共有分子功能GOSlim注解的蛋白相互作用對為74921對；在胚胎干細胞富集蛋白相互作用對中，共有分子功能GOSlim注解的蛋白相互作用對1682對。通過EASE方法分析42個GOSlim組合的903對GOSlim-GOSlim作用對在胚胎干細胞中富集得分，我們發(fā)現(xiàn)有66對GOSlim-GOSlim組合在胚胎干細胞中富集。進一步采用Cytoscape軟件作圖，我們發(fā)現(xiàn)除了GO：0030234之外，其它GOSlim術(shù)語均形成一個連續(xù)

16、的相互作用網(wǎng)絡(luò)，在此GOSlim功能相互作用網(wǎng)絡(luò)中，前4個最高連接的GOSlim術(shù)語分別為：GO：0003677，DNA binding； GO：0016787，hydrolase activity；GO：0003723，RNA binding； GO：0003824，catalytic activity。而且，我們研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)功能相互作用對，涉及轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，這和干細胞自我更新和多潛能維持、無限增殖特性密切相關(guān)。 總之，我

17、們的研究已經(jīng)鑒定了由403個胚胎干細胞高表達基因組成的一個富集蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，并進一步發(fā)現(xiàn)了一個富集的功能相互作用網(wǎng)絡(luò)。這些相互作用網(wǎng)絡(luò)對維持胚胎干細胞功能特征可能具有非常重要的作用，在胚胎干細胞富集蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中的中心蛋白，如MYC，H2AFX，RUVBL1，DDX18，CDC2，HDAC2，HISTIH4C等，可能在胚胎干細胞命運決定中具有非常重要作用，值得我們以后進一步深入探討。但是由于目前蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)不完全，以及高通量