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1、目的：構(gòu)建包含心臟肌鈣蛋白T啟動(dòng)子（cTnT啟動(dòng)子）和miR361-PSR(hCGin-miR361-PDE9AshRNA)表達(dá)框的重組質(zhì)粒，包裝6型重組腺相關(guān)病毒(rAAV6-cTnT-miR361-PSR)，體外轉(zhuǎn)導(dǎo)原代心肌細(xì)胞，應(yīng)用RNA干擾原理，下調(diào)PDE9A基因的表達(dá)，觀察原代心肌細(xì)胞中PDE9A基因mRNA和蛋白水平的變化。
方法：⑴構(gòu)建基于miRNA361骨架靶向下調(diào)PDE9A表達(dá)的shRNA片段（miR361-
2、PSR片段），與質(zhì)粒pAAV-cTnT-null進(jìn)行雙酶切(BamHⅠ、NotⅠ)，將得到酶切片段連接構(gòu)成重組質(zhì)粒pAAV-cTnT-miR361-PSR。⑵將pAAV-cTnT-miR361-PSR重組質(zhì)粒、pAAV6包裝質(zhì)粒及輔助質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，獲得rAAV6-cTnT-miR361-PSR病毒。用SDS-PAGE測(cè)定病毒純度和Dot Blot法測(cè)定病毒滴度。⑶重組病毒rAAV6-cTnT-miR361-PSR轉(zhuǎn)導(dǎo)乳鼠原代心
3、肌細(xì)胞，提取mRNA和蛋白質(zhì)，用RT-PCR和Western Blot法測(cè)定PDE9A基因的表達(dá)水平的變化。
結(jié)果：①成功構(gòu)建pAAV-cTnT-miR361-PSR重組質(zhì)粒。②成功包裝rAAV6-cTnT-miR361-PSR重組病毒。③rAAV6-cTnT-miR361-PSR重組病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)原代心肌細(xì)胞后PDE9A基因的mRNA和蛋白量均明顯低于對(duì)照組。
結(jié)論：成功包裝rAAV6-cTnT-miR361-PSR重組
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