rAAV9載體介導(dǎo)Tβ4基因靶向治療心肌缺血的體外研究.pdf

1、目的：
　　 構(gòu)建含有心肌特異性啟動(dòng)子心臟肌鈣蛋白T啟動(dòng)子（cTnT啟動(dòng)子）和胸腺肽β4(Thymosinβ4，Tβ4)基因并引入Myc標(biāo)簽的重組腺相關(guān)病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)載體質(zhì)粒pAAV-cTnT-Tβ4-Myc，CMV啟動(dòng)子介導(dǎo)的pAAV-CMV-Tβ4-Myc重組質(zhì)粒，并包裝6型和9型重組腺相關(guān)病毒，體外感染原代心肌細(xì)胞（Primary cardiomyoc

2、ytes），觀察rAAV6病毒介導(dǎo)Tβ4-Myc基因在原代心肌細(xì)胞中的表達(dá)。
　　 方法：
　　 1.pAAV-cTnT-Tβ4-Myc、pAAV-CMV-Tβ4-Myc重組質(zhì)粒構(gòu)建以pAAV-cTnT-Tβ4為模板，PCR特異性擴(kuò)增并插入BamHI、NotI雙酶切位點(diǎn)和引入Myc標(biāo)簽的Tβ4-Myc片段，再分別BamHI、NotI雙酶切Tβ4-Myc片段和現(xiàn)有質(zhì)粒pAAV-cTnT-Tβ4、pAAV-CMV-GFP，連

3、接構(gòu)建成重組質(zhì)粒pAAV-cTnT-Tβ4-Myc和pAAV-CMV-Tβ4-Myc。
　　 2.rAAV9-cTnT-Tβ4-Myc、rAAV6-CMV-Tβ4-Myc等重組病毒的包裝、檢測(cè)
　　 用pAAV-cTnT-Tβ4-Myc、pAAV-CMV-Tβ4-Myc等載體質(zhì)粒，含rep基因、cap基因的包裝質(zhì)粒pAAV6或pAAV9，輔助質(zhì)粒pHelper，通過(guò)三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，即可得到重組6型和9型腺相

4、關(guān)病毒載體，純化后的病毒采用Dot Blot法檢測(cè)病毒滴度，SDS-PAGE檢測(cè)病毒純度。
　　 3.rAAV6-CMV-Tβ4-Myc病毒表達(dá)功能的驗(yàn)證
　　 用rAAV6-CMV-Tβ4-Myc病毒感染原代心肌細(xì)胞，48h后進(jìn)行DAB染色、DAPI染色及兩者混合染色。
　　 4.rAAV6-CMV-TP4-Myc病毒表達(dá)的檢測(cè)
　　 用rAAV6-CMV-Tβ4-Myc病毒感染原代心肌細(xì)胞，提取蛋白后

5、行Western Blot檢測(cè)Tβ4-Myc基因的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.成功構(gòu)建了pAAV-cTnT-Tβ4-Myc、pAAV-CMV-Tβ4-Myc載體質(zhì)粒
　　 2.成功包裝了rAAV9-cTnT-Tβ4-Myc、rAAV6-CMV-Tβ4-Mye、rAAV6-CMV-GFP、rAAV9-CMV-GFP、rAAV6-CMV-GFP-Myc五種病毒。
　　 3.rAAV6-CMV-Tβ4-My

6、c病毒能在原代心肌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。
　　 4.rAAV6-CMV-Tβ4-Myc病毒感染原代心肌細(xì)胞后能介導(dǎo)Tβ4-Myc基因表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 成功構(gòu)建了重組腺相關(guān)病毒的載體質(zhì)粒pAAV-cTnT-Tβ4-Myc、pAAV-CMV-Tβ4-Myc。并包裝rAAV9-cTnT-Tβ4-Myc、rAAV6-CMV-Tβ4-Myc、rAAV6-CMV-GFP、rAAV9-CMV-GFP、rAAV6-CMV-GFP