NIS作為報告基因在心肌細(xì)胞中特異表達(dá)的研究.pdf

1、本文對NIS作為報告基因在心肌細(xì)胞中特異表達(dá)進(jìn)行了研究。本研究分為兩個部分：
　　 第一部分：
　　 目的：構(gòu)建肌凝蛋白輕鏈蛋白-2（mlc-2v）啟動子調(diào)控的人鈉碘同向轉(zhuǎn)運(yùn)體（hNIS）的腺病毒載體，探討NIS作為報告基因檢測目的基因在心肌細(xì)胞中特異性表達(dá)的可行性。
　　 方法：將mlc-2v啟動子和hNIS基因亞克隆至腺病毒穿梭載體，再與含有骨架質(zhì)粒pAdEasy-1的大腸桿菌BJ5183同源重組，經(jīng)HEK2

2、93細(xì)胞包裝并擴(kuò)增得到重組腺病毒Ad-mlc-NIS，同時構(gòu)建巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子調(diào)控的腺病毒Ad-cmv-NIS，僅含有啟動子的腺病毒Ad-mlc和僅含有NIS基因片段的腺病毒Ad-NIS作為對照組。腺病毒體外感染H9C2（大鼠心肌細(xì)胞）、A549(人肺腺癌細(xì)胞)和U87(人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞)，通過Western blot檢測NIS蛋白的表達(dá)，動態(tài)攝碘及NaClO4攝碘抑制實(shí)驗(yàn)觀察表達(dá)的NIS蛋白的功能和特性；臺盼藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)檢測腺病

3、毒及其NIS攝碘對心肌細(xì)胞活力和增殖的影響。
　　 結(jié)果：成功構(gòu)建了重組NIS腺病毒，受不同啟動子調(diào)控。重組腺病毒Ad-mlc-NIS和Ad-cmv-NIS分別感染心肌細(xì)胞系（H9C2細(xì)胞）和非心肌細(xì)胞系（A549細(xì)胞和U87細(xì)胞），Western blot示感染Ad-cmv-NIS的細(xì)胞中心肌細(xì)胞系（H9C2）和非心肌細(xì)胞系（A549和U87）均出現(xiàn)NIS蛋白的高表達(dá)。感染Ad-mlc-NIS的細(xì)胞，在非心肌細(xì)胞系中出現(xiàn)了微量

4、蛋白表達(dá)，在心肌細(xì)胞NIS蛋白的高表達(dá)。動態(tài)攝碘顯示感染Ad-mlc-NIS的心肌細(xì)胞攝碘約為對照組的10倍且能被NaClO4抑制，而對照組沒有明顯的攝碘功能；感染Ad-cmv-NIS的心肌細(xì)胞攝碘峰值較感染Ad-mlc-NIS的心肌細(xì)胞攝碘峰值低。臺盼藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)示在此實(shí)驗(yàn)條件下腺病毒感染和攝碘對心肌細(xì)胞活力和增殖的影響較小。
　　 結(jié)論：肌凝蛋白輕鏈蛋白-2（mlc-2v）啟動子調(diào)控的腺病毒載體可使外源基因NIS在心肌細(xì)胞內(nèi)特

5、異性表達(dá)，NIS基因作為報告基因可以有效的檢測目的基因的表達(dá)，為進(jìn)一步NIS作為報告基因監(jiān)測治療基因的表達(dá)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。
　　 第二部分：
　　 目的：通過引入內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)序列,構(gòu)建含有血管內(nèi)皮生長因子（VEGF165）和人鈉碘同向轉(zhuǎn)運(yùn)體（hNIS）的真核分泌穿梭載體pIRES-VEGF-NIS。體外檢測NIS蛋白和VEGF蛋白在HEK293和H9C2細(xì)胞中的表達(dá)，探討NIS作為報告基因監(jiān)測VEGF1

6、65治療基因表達(dá)的可行性。
　　 方法：PCR方法擴(kuò)增得到目的基因hNIS和VEGF165通過酶切連接亞克隆至pIRES載體獲得pIRES-VEGF-NIS質(zhì)粒。將IRES-VEGF-NIS片段亞克隆至質(zhì)粒pAdTRack-mlc質(zhì)粒，構(gòu)建好的質(zhì)粒通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，Western blot和免疫熒光檢測VEGF和NIS蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：成功構(gòu)建了雙基因共表達(dá)載體pIRES-VEGF-NIS。分別受巨

7、細(xì)胞病毒(CMV)和肌凝蛋白啟動子（mlc-2v）啟動子調(diào)控，Western blot顯示兩種啟動子調(diào)控的VEGF蛋白和NIS蛋白均可以同時在H9C2細(xì)胞中表達(dá)，但是在293細(xì)胞中僅有CMV啟動子調(diào)控的蛋白表達(dá)。免疫熒光示轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表達(dá)的VEGF蛋白位于胞漿，NIS蛋白位于細(xì)胞膜上。
　　 結(jié)論：IRES序列調(diào)控VEGF165與hNIS雙基因在細(xì)胞中可以同時獨(dú)立表達(dá)，且mlc-2v啟動子具有心肌特異性，為進(jìn)一步構(gòu)建雙基因表達(dá)重組