Pax8基因在調節(jié)小鼠心肌細胞生長與衰老中的作用研究.pdf

1、研究背景:先天性心臟病是全球性的健康問題，在兒童中的發(fā)病率很高，其最常見的類型包括房間隔缺損，室間隔缺損和動脈導管未閉。盡管醫(yī)學研究和技術在不斷進步和更新，先天性心臟病潛在的發(fā)病機制仍然不清楚。大約40％胚胎期死亡是由于先天性心臟發(fā)育異常引起的。心臟的發(fā)育是由基因和環(huán)境兩個因素共同調控的，基因對心臟發(fā)育的調控是復雜的，是多種基因和通路參與調控的綜合結果。在哺乳動物的發(fā)育生物上，心臟是最早形成的有功能的器官。在小鼠胚胎的第7.5天，心臟就

2、開始發(fā)育了。最早參與心臟發(fā)育調控的基因是Nkx2.5，之后，GATA, bHLH，Irx家族共同參與心臟發(fā)育的調控，參與調控的信號途徑主要有BMP，Wnt，Notch信號途徑等。BMP屬于TGF-β超家族，目前認為，至少存在6種在心臟特異表達的BMPs形式。BMP被認為在細胞凋亡、分化、增殖和形態(tài)發(fā)生中起重要作用。心臟特異性敲除ALK3的小鼠死于胚胎發(fā)育中期，伴有心臟發(fā)育異常，病理檢查發(fā)現(xiàn)存在室間隔缺損，心臟內膜墊形成障礙，以及肌小梁發(fā)

3、育異常。
　　我們實驗室基因芯片篩選發(fā)現(xiàn)，Pax8基因可能是ALK3基因的下游基因。Pax8屬于成對盒基因家族，在進化上屬于高度保守的序列。Pax8的表達有時空特異性，在終末分化的細胞中表達較少，但并不絕對，在甲狀腺，胸腺，胰腺和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等細胞中例外，在特殊的疾病如腫瘤的刺激下，Pax8蛋白表達也會升高，所以Pax8被認為是通過抑制終末分化和凋亡來調節(jié)組織生理病理功能的一種分子。
　　此前，Pax8在心臟方面的作用很少有

4、人研究，我們認為，Pax8可能在調節(jié)室間隔發(fā)育中有著重要的作用。通過系統(tǒng)性Pax8基因敲除小鼠心臟形態(tài)學研究發(fā)現(xiàn)，Pax8-/-純合子小鼠心臟比普通小鼠心臟小，呈球形，左室壁肥厚，左室乳頭肌肥大，并伴有室間隔缺損，心功能檢查中，超聲心動圖示舒張功能下降，電鏡檢查提示凋亡的心肌細胞增加，線粒體數(shù)量增加，但體積變小了。為了進一步探索Pax8與心臟發(fā)育的機制研究，我設計了以下實驗。在心臟發(fā)育的潛在機制中，凋亡與增殖的調節(jié)失衡可能導致間隔發(fā)育異

5、常。最新的研究表明，細胞衰老可能參與胚胎的發(fā)育。細胞衰老分為生理性的衰老和病理性的衰老，生理性的衰老主要參與有害細胞清除的機制和生物體發(fā)育，病理性衰老可以由多種危險因素觸發(fā)，如DNA損傷，線粒體代謝異常，內質網(wǎng)應激和端?？s短等。我們認為，細胞凋亡和細胞衰老可能共同參于Pax8基因敲除小鼠的心臟形成。
　　研究目的:1.驗證ALK3/Pax8通路在細胞凋亡中的作用;
　　2.探索細胞衰老是否參與了系統(tǒng)性Pax8基因敲除小鼠的心

6、臟發(fā)育;
　　3.構建心臟條件性Pax8敲除的小鼠模型，進一步驗證Pax8在心臟發(fā)育方面的作用。
　　方法:第一部分:構建Pax8真核表達載體和ALK3 shRNA載體，在H9C2心肌細胞株中，使ALK3低表達和Pax8高表達，Western blot觀察Caspase依賴的凋亡通路，形態(tài)學上進行DAPI染色觀察凋亡情況。CCK-8法檢測Pax8在增殖方面的作用。在小鼠原代培養(yǎng)的心肌細胞中，慢病毒包裝載體轉染高表達Pax8基

7、因，利用流式細胞儀進行AnnexinⅤ FITC/PI雙染檢測觀察能否緩解血清饑餓誘導的凋亡。第二部分:分別收集系統(tǒng)性敲除的Pax8-/-純合子，Pax8+/-雜合子和野生型小鼠，并建立時間梯度，收集胚胎期第18天(E18)，出生后第7天(P7)和出生后第14天(P14)小鼠心臟。熒光實時定量PCR檢測組織中衰老相關指標mRNA:周期蛋白激酶抑制劑（如p21，p53，p16，p19），線粒體代謝相關指標(PGC-1α，Cytc)和內質網(wǎng)

8、應激相關指標(XBP1，Erp72a)。Westren blot檢測衰老相關周期蛋白激酶抑制劑及衰老相關異染色質(HP1γ)蛋白水平。細胞衰老相關的半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色作為衰老標志替代染色。免疫組化和免疫熒光法在心臟組織切片上檢測周期蛋白激酶抑制劑和HP1γ。體外培養(yǎng)的H9C2心肌細胞株中檢測衰老相關指標的mRNA水平，初步觀察ALK3/Pax8通路與細胞衰老的關系。第三部分，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術，構建P

9、ax8基因sgRNA/Cas9載體，體外轉錄后與Cas9 mRNA共同注射小鼠受精卵原核，構建Pax8 flox/flox小鼠。
　　結果:第一部分:在H9C2心肌細胞株中，Pax8高表達部分挽救了ALK3沉默引起的細胞凋亡增加，并促進心肌細胞株增殖。在小鼠原代培養(yǎng)的心肌細胞中，進一步驗證了Pax8緩解細胞凋亡的作用。第二部分:相對于野生型小鼠，衰老細胞和衰老相關標志物在系統(tǒng)性敲除的Pax8-/-小鼠中更明顯，這種趨勢在年長的小鼠