LSDP5對(duì)小鼠心肌細(xì)胞脂滴代謝作用的初步研究.pdf

1、肥胖、糖尿病、高脂血癥和高血壓等脂肪代謝異常相關(guān)疾病共同構(gòu)成了代謝綜合征(MetabolicSyndrome，MS)，其已成為一類嚴(yán)重危害人類健康的疾病。脂肪是機(jī)體儲(chǔ)存能量的重要方式，主要以脂滴（LipidDroplets，LDs）的形式廣泛分布于各種組織細(xì)胞中。脂滴表面覆蓋有單層磷脂，磷脂內(nèi)部鑲嵌多種蛋白質(zhì)，被稱為脂滴相關(guān)蛋白。脂滴相關(guān)蛋白在脂滴代謝過程中發(fā)揮著重要作用，其中PAT蛋白家族是脂滴表面最為重要的結(jié)構(gòu)蛋白，包括perili

2、pin、ADRP（AdipocyteDifferentiation-RelatedProtein）、TIP47、S3-12和LSDP5（LipidStorageDropletProtein5）。LSDP5是PAT家族的最新成員，在以氧化脂肪酸為能量來源的組織（心臟、骨骼肌、肝臟等）中表達(dá)水平較高，尤以在心臟表達(dá)水平最高。目前LSDP5功能的研究多集中于COS-7細(xì)胞、肝細(xì)胞等細(xì)胞或組織；然而對(duì)心臟或心肌細(xì)胞內(nèi)脂肪代謝的影響尚不明確，為了

3、明確其對(duì)心臟脂肪代謝的影響，本實(shí)驗(yàn)就LSDP5對(duì)小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)脂滴代謝作用進(jìn)行了研究。
　　目的
　　明確油酸對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)LSDP5mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響，通過構(gòu)建LSDP5過表達(dá)和沉默的重組腺病毒，進(jìn)而明確LSDP5對(duì)心肌細(xì)胞脂滴代謝的影響。
　　方法
　　1、分離培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞，給予不同濃度油酸24h，采用Bodipy493/503熒光染色觀察脂滴變化；分別提取細(xì)胞總RNA和蛋白質(zhì)，采用Real-t

4、imePCR和Westernblot技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)LSDP5mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。
　　2、利用AdEasyTMXL腺病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建分別能夠過表達(dá)和沉默LSDP5的重組腺病毒Ad-HA-LSDP5和Ad-si-LSDP5。將pCMV5-HA質(zhì)粒和pSilencer-si-LSDP5質(zhì)粒分別連接至穿梭載體pShuttle，酶切線性化后轉(zhuǎn)化至BJ5183感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行同源重組，篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，酶切線性化并轉(zhuǎn)染AD29

5、3細(xì)胞，提取重組腺病毒，分別用PCR和Westernblot技術(shù)鑒定，擴(kuò)增病毒并檢測(cè)病毒滴度。
　　3、利用構(gòu)建的重組腺病毒分別感染心肌細(xì)胞，Westernblot檢測(cè)重組腺病毒對(duì)LSDP5表達(dá)的影響。同時(shí)用100μM/L油酸誘導(dǎo)和Bodipy493/503染色觀察各組脂滴形態(tài)。
　　結(jié)果
　　1、分離的乳鼠心肌細(xì)胞經(jīng)油酸刺激后，細(xì)胞內(nèi)脂滴增大，同時(shí)LSDP5的mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平升高。
　　2、重組腺病毒

6、Ad-HA-LSDP5和Ad-si-LSDP5病毒經(jīng)PCR擴(kuò)增顯示，前者可擴(kuò)增出1400bp左右的片段，后者未能擴(kuò)增出目的條帶。重組腺病毒分別感染AD293細(xì)胞，Westernblot檢測(cè)顯示，二者分別能使細(xì)胞內(nèi)LSDP5過表達(dá)和沉默。
　　3、構(gòu)建的腺病毒能有效地在心肌細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)或沉默LSDP5。病毒感染乳鼠心肌細(xì)胞并給予100μM/L油酸刺激后，過表達(dá)LSDP5的細(xì)胞內(nèi)脂滴的數(shù)量增加，體積增大；沉默LSDP5的細(xì)胞內(nèi)脂滴的數(shù)