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文檔簡介
1、背景冠狀動脈硬化性疾病(coronaryatherosclerosisdisease,CAD)是心血管系統(tǒng)的常見疾病,是發(fā)達國家的常見死因,在發(fā)展中國家的發(fā)病率也迅速上升。CAD發(fā)病機制復雜,在其發(fā)展過程中,血管內皮細胞的損傷、血小板和凝血因子的活化、體內促凝與抗凝的失衡、高血脂、高血粘度及血流動力學改變等因素均促進粥樣斑塊和血栓形成。然而其原發(fā)因素和發(fā)病機理仍不清楚。關于CAD的發(fā)病機制有多種學說,其中炎癥學說備受重視,越來越多的證據
2、表明炎癥在冠心病的發(fā)生、發(fā)展和預后過程中起很重要的作用。炎癥因子與冠心病的發(fā)生、發(fā)展和預后的關系是目前冠心病研究領域的一個熱點,揭示炎癥因子與冠心病的關系有重要臨床意義。大量臨床研究表明,C-反應蛋白(C-reactiveprotein,CRP)與冠心病的發(fā)生、發(fā)展、危險度分層以及預后密切相關,因此CRP作為冠心病的獨立危險因素之一,被認為是預測未來心血管危險的重要炎癥標記物。然而CRP與冠心病的內在聯(lián)系尚未明了,CRP是否僅僅作為冠心
3、病發(fā)生、發(fā)展過程中伴隨炎癥而出現(xiàn)的一種標志物(passivebystander),還是直接參與了冠心病的發(fā)生、發(fā)展和預后(culprit)?最近的研究發(fā)現(xiàn),在早期動脈粥樣硬化斑塊中有CRP沉積,表明CRP與早期粥樣硬化斑塊的形成存在病理上的聯(lián)系,而且CRP與斑塊的不穩(wěn)定相關。此外,CRP還能抑制血管內皮細胞分泌NO、介導血管平滑肌凋亡。在急性心肌梗死患者心臟的梗死區(qū)也有CRP沉積,而且CRP的含量與梗死的范圍呈正相關。一些嚴重的急性冠脈
4、綜合征(acutecoronarysyndrome,ACS)和感染病人血中CRP達到300mg/L,如此高的CRP濃度是否對心肌有直接損傷作用,尚未見文獻報道。本研究通過CRP干預體外培養(yǎng)的大鼠心肌細胞了解其對心肌細胞的直接作用以及可能的機制,以進一步探討CRP的致病機制并為冠心病提供可能的新的治療靶點。 目的:選擇識別鼠等動物的抗cTnI單抗,配對建立可用于檢測大鼠心肌肌鈣蛋白Ⅰ(cardiactroponinI,cTnI)的
5、ELISA方法,對心肌細胞損傷進行評價。從腹水中純化人CRP,干預原代培養(yǎng)的大鼠乳鼠心肌細胞,觀察CRP與細胞作用的部位,研究CRP對心肌細胞培養(yǎng)上清cTnI、氧自由基清除及脂質過氧化的影響,對細胞內鈣離子濃度、線粒體膜電位以及細胞凋亡的影響。 方法:1.以大鼠心肌勻漿代替cTnI篩選可識別大鼠cTnI的一對單抗組合,以這對單抗分別作為捕捉抗體和信號抗體建立能檢測大鼠cTnI的雙抗夾心ELISA系統(tǒng),通過檢測異丙腎上腺素損傷大鼠
6、血清中cTnI濃度,驗證該系統(tǒng)的效果。 2.采用Immobilizedp-AminophenylPhosphorylCholineGel親和層析柱從腫瘤患者腹水中純化CRP,通過電泳和westernblot對純化產物的純度和活性進行分析和鑒定。 3.培養(yǎng)SD大鼠乳鼠心肌細胞,通過充氮氣造成缺氧/復氧損傷模型,加入CRP干預72小時,實驗分為未缺氧組、缺氧2小時組、缺氧4小時組和缺氧8小時組,每一組又分為4個亞組:未加CR
7、P組、CRP10μg/ml組、CRP55μg/ml組與CRP100μg/ml組。 4.觀察CRP干預對細胞形態(tài)、搏動率、密度以及培養(yǎng)液上清的影響。 5.通過免疫組化和免疫熒光定位確定CRP與細胞作用的部位、結合量。 6.通過檢測細胞培養(yǎng)上清cTnI與細胞超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量,了解CRP對心肌細胞的損傷作用和因缺氧/復氧造成的心肌細胞脂質過氧化的影響。 7.通過激光共聚焦檢測細胞內游離鈣離子濃度(
8、Fura-3/AM)、線粒體膜電位(羅丹明123),了解CRP對培養(yǎng)心肌細胞肌漿網鈣負荷變化的影響和對細胞能量代謝的影響。 8.通過流式細胞檢測了解CRP對心肌細胞凋亡的影響。 結果1.篩選出一對可識別大鼠cTnI的單抗(14和15號單抗),用這對單抗建立的雙抗夾心ELISA系統(tǒng)可檢測出6.125ng/ml的大鼠心肌勻漿(約相當于0.225ng/ml的cTnI)。用上述系統(tǒng)檢測異丙腎上腺素損傷大鼠血清中cTnI的濃度,結
9、果明顯高于生理鹽水對照組(P<0.05)。 2.采用親和層析法從腫瘤患者腹水中成功純化出CRP,電泳檢測純度約為95﹪,westernblot檢測未見雜帶。 3.缺氧8小時加CRP100μg/ml條件下細胞密度明顯減少,胞質突起變細變長,胞內有明顯的致密顆粒,視野內可見大量細胞碎片。細胞搏動率總體隨缺氧時間和CRP濃度的增加而增加,其通常在缺氧2小時加CRP100μg/ml條件下以及缺氧4小時加CRP55μg/ml時搏動
10、率最高,約為132次/分鐘左右。但在缺氧8小時組細胞搏動率普遍低于其他各組,細胞搏動率約為30-40次/分鐘左右,大部分細胞未見搏動,只有少數(shù)聚集呈團的細胞可見搏動,且搏動極不規(guī)則。尤其在缺氧8小時加CRP100μg/ml組細胞幾乎未見細胞搏動。培養(yǎng)液上清顏色隨缺氧時間和CRP濃度的增加而變黃(PH值降低)。 4.免疫組化和免疫熒光定位顯示CRP主要與細胞膜結合,細胞缺氧時間越長,CRP濃度越高,與細胞膜結合的CRP越多。其中細
11、胞裂解碎片上結合的CRP最多。 5.在未缺氧組和缺氧2、4小時組細胞培養(yǎng)上清cTnI濃度隨缺氧時間的增加而升高。缺氧8小時組的cTnI濃度在缺氧2小時和4小時之間,各組cTnI濃度均隨CRP濃度的增加而增加。但在未缺氧組,低濃度的CRP亞組(10μg/ml)cTnI的濃度與未加CRP組無顯著性差異。且隨缺氧時間的增加,因CRP而引起cTnI變化的幅度也明顯增加(P<0.05)。 6.MDA的改變與cTnI類似。在所有組S
12、OD活性均隨缺氧時間和CRP濃度的增加而減少。但未缺氧組,CRP10、55μg/ml的細胞上清以及缺氧2小時加CRP10μg/ml條件下的細胞上清中SOD活性與相應未加CRP組無顯著性差異。且隨缺氧時間的增加,因CRP而引起MDA和SOD變化的幅度也明顯增加(P<0.05)。 7.細胞內游離鈣離子濃度隨缺氧時間和CRP濃度的增加而增加(P<0.05)。而線粒體膜電位缺氧時間和CRP濃度的增加而減少(P<0.05)。 8.
13、細胞凋亡率隨缺氧時間延長和CRP濃度的升高而增加(P<0.05)。 結論1.本研究在國內首次建立了一個可識別大鼠cTnI的ELISA檢測系統(tǒng)。該系統(tǒng)可用于大鼠心肌損傷的檢測,為評價大鼠心肌損傷的實驗提供了一個有用的工具。 2.采用PhosphorylCholine親和層析柱從腹水中純化CRP,所得產物純度較高、方法簡單且效率高。 3.采用純氮氣造成缺氧模型時,缺氧8小時可造成大量細胞不可逆的損傷,由于所剩細胞較其
14、他組明顯減少,所以對細胞上清cTnI、SOD和MDA的結果可產生較大影響,與其他缺氧組不具可比性。討論CRP對細胞的影響時應將缺氧損傷控制在可逆性的范圍之內。 4.免疫組化和免疫熒光定位結果表明細胞損傷越嚴重,細胞膜結合的CRP就越多;或者可能是細胞膜結合的CRP越多,細胞損傷越嚴重;或者兩者互為因果。 5.細胞培養(yǎng)上清cTnI、SOD和MDA結果表明,CRP作用于損傷組細胞可進一步加重細胞損傷,且相同濃度的CRP在已有
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