Hela細(xì)胞與人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中miRNA Let-7及其靶基因的關(guān)系研究.pdf

1、MicroRNAs(miRNAs)是一類在進(jìn)化上高度保守的，內(nèi)源性非編碼小分子RNA，它可以通過(guò)與靶基因mRNA的3'UTR互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合的方式特異性的降解靶基因的mRNA或者抑制靶基因mRNA的翻譯從而調(diào)控基因的表達(dá)。MicroRNA let-7最早在秀麗隱桿線蟲(chóng)(C.elegans)中發(fā)現(xiàn)，與線蟲(chóng)的生長(zhǎng)，時(shí)序性發(fā)育和從幼蟲(chóng)到成蟲(chóng)的形態(tài)轉(zhuǎn)換有關(guān)。目前，在人的基因組中，有13種前體序列，能夠生成10種成熟的let-7 miRNAs。我們先

2、前的研究表明let-7在流產(chǎn)蛻膜中的表達(dá)顯著低于在早孕蛻膜中的表達(dá)。假設(shè)let-7可以通過(guò)調(diào)控靶基因的表達(dá)參與早期妊娠維持。
　　目的；⑴預(yù)測(cè)let-7f-5p，let-7g-5p和let-7i-5p的靶基因；⑵在體外水平驗(yàn)證let-7f-5p，let-7g-5p和let-7i-5p與各自候選靶基因的靶向關(guān)系。
　　方法；利用在線分析軟件(Target Scan，PicTar和MiRanda等)預(yù)測(cè)let-7f-5p，let

3、-7g-5p和let-7i-5p的靶基因。在三種不同的人的細(xì)胞系HEK293T, Hela和H-ESCs中過(guò)表達(dá)或敲減let-7f-5p，let-7g-5p，let-7i-5p后在mRNA和蛋白水平檢測(cè)各自候選靶基因的表達(dá)。
　　結(jié)果：①IGF2BP-1 mRNA3'UTR有l(wèi)et-7f-5p的結(jié)合位點(diǎn);在HEK293T, Hela和H-ESCs這三種不同的細(xì)胞中轉(zhuǎn)染let-7f-5p模擬物后，qRT-PCR結(jié)果表明，IGF2BP

4、-1 mRNA的表達(dá)均顯著減少(P＜0.05);轉(zhuǎn)染let-7f-5p抑制劑后，IGF2BP-1的表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.05)。此外，在Hela細(xì)胞中過(guò)表達(dá)let-7f-5p后，同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(iTRAQ)的結(jié)果顯示IGF2BP-1蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)(P＜0.05);抑制let-7f-5p后，iTRAQ的結(jié)果顯示IGF2BP-1蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.05)。②IGF-2R mRNA3'UTR有l(wèi)et-7g-5p的結(jié)合位點(diǎn)

5、;在Hela細(xì)胞中轉(zhuǎn)染let-7g-5p模擬物后，qRT-PCR和ELISA的結(jié)果顯示，IGF-2RmRNA和蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.05)。轉(zhuǎn)染let-7g-5p抑制劑后，qRT-PCR和ELISA的結(jié)果顯示，IGF-2R mRNA和蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)(P＜0.05)。③LIF和IL-6 mRNA3'UTR都有l(wèi)et-7i-5p的結(jié)合位點(diǎn);在HEK293T, Hela和H-ESCs細(xì)胞中轉(zhuǎn)染let-7i-5p模擬物后，qRT-PC

6、R的結(jié)果表明，三種細(xì)胞中LIF和IL-6 mRNA的表達(dá)均顯著升高(P＜0.05)。轉(zhuǎn)染let-7i-5p抑制劑后，LIF和IL-6 mRNA的表達(dá)顯著降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論：IGF2BP-1可能是let-7f-5p的一個(gè)靶基因，let-7f-5p可以靶向負(fù)調(diào)控IGF2BP-1的表達(dá)。在mRNA水平，let-7i-5p與LIF和IL-6的表達(dá)呈正相關(guān)。在Hela細(xì)胞中，let-7g-5p的表達(dá)與IGF-2R的表達(dá)正相關(guān)，