擬穴青蟹抗菌肽Scygonadin及聯(lián)合多肽Scy-hepc的表達(dá)和抗菌、抗病毒功能研究.pdf

1、抗菌肽(antimicrobial peptide)是先天性免疫的重要組分,廣泛存在于生物界的各個(gè)門類,進(jìn)化上相對(duì)保守,具有廣譜的抗菌、抗病毒和抗腫瘤等作用?？咕木哂锌梢姷膽?yīng)用前景,但直接從動(dòng)物體提取抗菌肽不適于未來產(chǎn)業(yè)化的要求。本研究利用本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定的擬穴青蟹抗菌肽Scygonadin基因和大黃魚抗菌肽Hepcidin基因,通過基因工程技術(shù)構(gòu)建了Soygonadin基因及與大黃魚抗菌肽Hepcidin基因聯(lián)合的基因工程穩(wěn)定表達(dá)菌

2、株,優(yōu)化其表達(dá)與純化工藝,研究其基因表達(dá)產(chǎn)物的抗菌與抗病毒活性、抗菌機(jī)制以及抗菌(毒)譜,為未來抗菌肽的產(chǎn)業(yè)化提供技術(shù)支撐；同時(shí)利用基因表達(dá)產(chǎn)物制備Scygonadin的抗體,闡明了Scygonadin蛋白在雄性擬穴青蟹的組織表達(dá)定位,為Scygonadin目標(biāo)性應(yīng)用以及其功能的深入研究奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.Scygonadin基因在大腸桿菌中的表達(dá)及其抗菌活性:構(gòu)建了Scygonadin基因的兩種融合表達(dá)載體

3、pTrc-CKS/scygonadin和pET28-scygonadin,融合蛋白CKS-scygonadin主要以可溶性形式表達(dá),分子量為43kDa,經(jīng)3C蛋白酶酶切,兩次親和純化后,獲得了11kDa的目的蛋白Seygonadin,產(chǎn)量為10.6mg/L。以pET28a為載體表達(dá)的Scygonadin主要以可溶性形式表達(dá),經(jīng)一次親和純化后即獲得目的蛋白,產(chǎn)量為65.9mg/L。體外抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,上述兩種原核表達(dá)的scygonadi

4、n抗菌譜相似,能選擇性地抑制革蘭氏陽性和陰性菌,在所測(cè)濃度下對(duì)酵母和真菌無抗性(>60μM)；30μM的Scygonadin能在較短時(shí)間內(nèi)(30分鐘)殺滅全部的金黃色葡萄球菌。比較發(fā)現(xiàn),pET28-scygonadin是一個(gè)較理想的原核表達(dá)載體。
　　 2.Scygonadin基因在畢赤酵母中的表達(dá)及其抗菌活性:體外構(gòu)建了Scygonadin基因的真核表達(dá)載體pPIC9K—scygonadin,轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115,甲醇誘導(dǎo)后

5、在培養(yǎng)上清中檢測(cè)到目的蛋白Scygonadin。并用親和層析純化表達(dá)產(chǎn)物,產(chǎn)量為20mg/L。與原核表達(dá)產(chǎn)物Scygonadin比較,真核表達(dá)的Scygonadin具有較強(qiáng)的抗菌活性。
　　 3.Scygonadin蛋白在雄性擬穴青蟹的組織定位:利用pET28-scygonadin表達(dá)純化的Scygonadin蛋白免疫Balb/c小鼠,制備Scygonadin抗體。利用Scygonadin抗體,通過SDS-PAGE、Wester

6、n—blot和質(zhì)譜分析檢測(cè)了成熟雄性擬穴青蟹各組織的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)與其基因的表達(dá)相對(duì)應(yīng),Scygonadin蛋白在射精管中高表達(dá),且顯著高于其它組織。
　　 4.聯(lián)合多肽Scy-hepc在大腸桿菌中的表達(dá)、抗菌活性和抗菌機(jī)理:根據(jù)Scygonadin和Hepcidin基因的cDNA序列,將兩基因進(jìn)行合理拼接,構(gòu)建了聯(lián)合多肽原核表達(dá)載體pET28-scy/hepc,在大腸桿菌BL21(DE3)plysS菌株中誘導(dǎo)表達(dá),獲得24kD

7、a的融合蛋白。利用pET28-scy/hepc表達(dá)載體的C端6×His-Tag,通過親和層析純化聯(lián)合多肽Scy-hepc,產(chǎn)量為60mg/L。聯(lián)合表達(dá)產(chǎn)物Scy—hepc具有較強(qiáng)的抑菌和殺菌能力,顯著高于原核表達(dá)產(chǎn)物Scygonadin。Scy-hepc(12.5μM,MBC)可在30分鐘殺滅90％以上的金黃色葡萄球菌,在1.5-2小時(shí)殺滅90％以上的施氏假單胞菌:Scy-hepc(50μM,MBC)對(duì)藤黃微球菌具有相對(duì)緩慢的殺菌過程,

8、在4小時(shí)可殺死90％以上的藤黃微球菌。將原核表達(dá)的聯(lián)合Scy-hepc與施氏假單胞菌孵育2小時(shí)后,通過掃描電鏡觀察到施氏假單胞菌表面結(jié)構(gòu)崎嶇不平,有泡狀隆起,大量細(xì)菌可見內(nèi)容物外泄。
　　 5.聯(lián)合多肽Scy-hepc在畢赤酵母中的表達(dá)、抗菌活性:通過優(yōu)化密碼子,構(gòu)建了三種Scygonadin和Hepcidin的真核串聯(lián)表達(dá)載體,分別為pPIC9K—scy/hepc、pPIC9K-scy/hepc(6CAC)和pPIC9K-sc

9、y/hepc(6CAT),其中pPIC9K-scy/hepc轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115后獲得較高表達(dá)量。通過培養(yǎng)條件優(yōu)化,Scy-hepc在培養(yǎng)基初始值為pH6.0,甲醇濃度為0.75％條件下,誘導(dǎo)表達(dá)36小時(shí),可獲得最高表達(dá)量,約為23mg/L。真核表達(dá)產(chǎn)物Scy-hepc具有廣譜的抗菌活性,與原核表達(dá)產(chǎn)物Scy-hepc比較,真核表達(dá)的Sey-hepc抗菌活性更強(qiáng),對(duì)水產(chǎn)致病菌如嗜水氣單胞菌和熒光假單胞菌的抑殺菌活性(MIC1.6-3.

10、2μM)顯著高于原核表達(dá)產(chǎn)物Scy-hepc(MIC25-50μM)。
　　 6.重組表達(dá)的Scygonadin和Scy-hepc成熟肽的抗病毒活性:體外制備紅螯螯蝦的造血組織干細(xì)胞(Hpt),分別用真核表達(dá)產(chǎn)物Scygonadin、Scy—hepc和化學(xué)合成的Hepcidin成熟肽,以不同的方式作用于對(duì)蝦白斑病毒(WSSV),通過檢測(cè)病毒復(fù)制的極早期基因IE1的表達(dá)情況判斷三種受試抗菌肽的抗病毒效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:真核表達(dá)產(chǎn)物