擬穴青蟹(Scylla paramamosain)Histone 2A的基因克隆、表達(dá)及其合成肽Sphistin的抗菌特性與抗菌機(jī)理研究.pdf

1、擬穴青蟹(Scylla paramamosain)是我國南部沿海重要經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖品種,由于缺乏擬穴青蟹的相關(guān)免疫知識(shí),迄今無法真正實(shí)現(xiàn)擬穴青蟹的健康養(yǎng)殖?？咕念惖拿庖咭蜃釉诤Ｑ髣?dòng)物的先天性免疫中具有重要作用,因此挖掘新的抗菌肽對揭示擬穴青蟹的免疫機(jī)制具有重要的科學(xué)意義。組蛋白Histone是真核生物染色體的基本結(jié)構(gòu)蛋白,一些研究證明組蛋白的成分具有抗菌活性。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中,從LPS刺激的擬穴青蟹血細(xì)胞SSH cDNA文庫中篩選到一個(gè)

2、類似Histone2A的基因,推測其可能在擬穴青蟹體內(nèi)具有抗菌等免疫功能,因而對其進(jìn)行了細(xì)致的研究工作,取得了以下研究成果。
　　 ⑴闡明了擬穴青蟹Histone2A的cDNA全長序列。擬穴青蟹Histone2AcDNA序列(GeneBank登錄號為FJ774663)全長1096 bp,包含一個(gè)384 bp的開放閱讀框,編碼128個(gè)氨基酸,其理論分子量為13463.6 Da,等電點(diǎn)為10.58。
　　 ⑵合成肽Histo

3、ne2A具有顯著的抗菌活性,命名為Sphistin。利用生物信息學(xué)分析了擬穴青蟹Histone2A基因序列和氨基酸序列特征,通過化學(xué)合成方法合成了擬穴青蟹Histone2A N端前38個(gè)氨基酸。采用液體倍比稀釋法測定了Histone2A合成肽對8種革蘭氏陽性菌、13種革蘭氏陰性菌、2種酵母菌的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)。結(jié)果顯示Histone2A合成肽對重要的水產(chǎn)致病菌嗜水氣單胞菌等7種革蘭氏陰性菌、人畜致病菌金黃葡

4、萄球菌、表皮葡萄球菌等4種革蘭氏陽性菌均有抑菌作用和殺菌作用,大部分MIC濃度小于6μM,對畢赤酵母菌同樣有抑殺作用。結(jié)果表明Histone2A基因的合成肽具有生物活性,將其命名為Sphistin。用Sphistin對金黃葡萄球菌、大腸桿菌MC1061和谷氨酸棒桿菌的殺菌動(dòng)力學(xué)曲線研究表明,1.5μM Sphistin可在2 h殺滅90％以上的谷氨酸棒桿菌；3μM Sphistin可在10 min殺滅90％以上的金黃色葡萄球菌;25μM

5、 Sphistin在3h可以殺滅90％以上的大腸桿菌MC1061。
　　 ⑶Sphistin對腫瘤細(xì)胞具有抑制作用。使用鼠正常成骨細(xì)胞MC3T3-E1和人肝癌細(xì)胞HepG2檢測Sphistin對細(xì)胞的毒性程度。將0-100μg/mL Sphistin分別與兩種細(xì)胞共孵24h,在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),并應(yīng)用MTT法檢測細(xì)胞相對活力。結(jié)果表明0-100μg/mL濃度范圍內(nèi)的Sphistin對鼠正常成骨細(xì)胞MC3T3-E1沒有明顯的細(xì)

6、胞毒性；而不同濃度的Sphistin對人肝癌細(xì)胞HepG2均表現(xiàn)出抑制細(xì)胞活力的作用。將100μg/mL Sphistin與HepG2細(xì)胞共孵24 h后,細(xì)胞相對活力降低了20％。細(xì)胞形態(tài)觀察和MTT檢測細(xì)胞活性結(jié)果表明,Sphistin對正常細(xì)胞無明顯細(xì)胞毒性,而對癌細(xì)胞有抑制作用。
　　 ⑷Sphistin具有破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的能力。大腸桿菌MC1061工程菌質(zhì)粒經(jīng)改造后在細(xì)菌內(nèi)部表達(dá)熒光素酶,使用大腸桿菌MC1061檢測Sp

7、histin與細(xì)胞膜作用的情況。大腸桿菌MC1061與高濃度(25μM和50μM)的Sphistin作用后,熒光發(fā)光量顯著高于陰性對照蛋白組(六勝肽),表明其迅速破壞了細(xì)菌的細(xì)胞外膜結(jié)構(gòu),使細(xì)菌死亡。而大腸桿菌MC1061與較低濃度(12.5μM)Sphistin的作用后,熒光檢測結(jié)果表明低濃度的Sphistin僅是抑制了細(xì)菌的繁殖卻并未殺死細(xì)菌。高濃度和低濃度的Sphistin與大腸桿菌MC1061作用結(jié)果證明了Sphistin是一種

8、破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的蛋白,可以增強(qiáng)細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性和破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)。
　　 ⑸獲得了擬穴青蟹Histone2A的基因表達(dá)產(chǎn)物。利用pET-32a+、pET-28a+和pBV220構(gòu)建了三個(gè)Histone2A基因的原核表達(dá)載體,其中pET-32a+和pBV220載體在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)了Histone2A目的蛋白,帶有Trx·tag標(biāo)簽的pET32a表達(dá)產(chǎn)物分子量30 kDa,含有283個(gè)氨基酸,等電點(diǎn)為9.3,為上清表達(dá)；p