擬穴青蟹(Scylla Paramamosain)抗菌肽Sphistin抗菌結(jié)構(gòu)域的篩選、抗菌機(jī)制及其調(diào)控區(qū)分析.pdf

1、擬穴青蟹(Scylla paramamosain，簡(jiǎn)稱青蟹)是我國(guó)東南沿海重要的經(jīng)濟(jì)蟹類養(yǎng)殖品種，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，但其養(yǎng)殖過(guò)程中易受到微生物感染而降低其存活率?？咕氖巧矬w先天性免疫的重要組成部分，對(duì)外源病原體產(chǎn)生防御作用。因此，獲得高抗性抗菌肽對(duì)于水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中微生物病害的防治具有重要意義。自1958年Hirsch等人通過(guò)研究證實(shí)了組蛋白的抗菌功能以來(lái)，組蛋白H2A的抗菌功能被廣泛關(guān)注。本研究在前期獲得擬穴青蟹Histone2A

2、合成肽Sphistin（由38個(gè)氨基酸組成）的基礎(chǔ)上，對(duì)于抗菌肽Sphistin的高抗性功能域進(jìn)行了探索，獲得了具有高抗性的Sphistin[12-38]，并對(duì)其抗菌活性、抗菌機(jī)制、調(diào)控機(jī)制以及對(duì)細(xì)菌感染后機(jī)體的免疫保護(hù)作用等進(jìn)行了深入研究，具體成果如下:
　　1.獲得了抗菌肽Sphistin活性高的抗菌結(jié)構(gòu)域。根據(jù)抗菌肽Sphistin蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果，對(duì)Sphistin進(jìn)行蛋白分段，通過(guò)化學(xué)合成獲得多段分段肽。對(duì)于各分段肽

3、進(jìn)行抗菌活性檢測(cè)，證明分段肽Sphistin[12-38]與抗菌肽Sphistin相比具有更高抗菌活性，且抗菌譜更廣，對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）、溶壁微球菌（Micrococcuslysodeikticus fleming）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluoresce

4、ns）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、溫和氣單胞菌(Aeromonas sobria)等細(xì)菌具有很好的抑殺作用，MIC低于3μM。殺菌動(dòng)力學(xué)曲線表明，短肽Sphistin[12-38]對(duì)溫和氣單胞菌的殺菌指數(shù)可在6h內(nèi)達(dá)到100％。
　　2.闡明了Sphistin[12-38]的抗菌機(jī)制。大腸桿菌MC1061破膜實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Sphistin[12-38]濃度高于25μM后能夠引起細(xì)菌細(xì)胞膜通透性發(fā)生改

5、變。DNA結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Sphistin[12-38]濃度高于12μM后能夠與大腸桿菌的基因組DNA結(jié)合。用共聚焦激光掃描顯微鏡（confocal laser scanning microscopy, CLSM）觀察經(jīng)過(guò)FITC熒光標(biāo)記的Sphistin[12-38]與溫和氣單胞菌互作后的定位情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)熒光信號(hào)集中于細(xì)菌胞內(nèi)，證明Sphistin[12-38]能夠進(jìn)入細(xì)菌胞質(zhì)內(nèi)抗菌。
　　3.證明了Sphistin[12-

6、38]作為外源蛋白的安全性。使用子宮頸癌細(xì)胞Hela和青蟹血絀胞檢測(cè)Sphistin[12-38]的細(xì)胞毒性，結(jié)果表明Sphistin[12-38]濃度在0-100μg/mL范圍內(nèi)對(duì)正常青蟹血細(xì)胞沒(méi)有明顯細(xì)胞毒性，但無(wú)明顯的抗腫瘤作用。通過(guò)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，Sphistin[12-38]濃度在0-100μg/mL范圍內(nèi)與兩種細(xì)胞共孵24h后并不會(huì)引起細(xì)胞形態(tài)的改變。另外，將Sphistin[12-38]注射海水青鳉后不會(huì)引起海水青鳉機(jī)體的

7、免疫反應(yīng)，證明Sphistin[12-38]作為外源蛋白是安全的。
　　4.證明了Sphistin[12-38]可以提高海水青鳉存活率。將Sphistin[12-38]與溫和氣單胞菌混合后共注射海水青鳉，與單獨(dú)注射溫和氣單胞菌的海水青鳉相比，在注射后7天內(nèi)，注射Sphistin[12-38]的海水青鳉存活率有明顯提高，證明Sphistin[12-38]可以在溫和氣單胞菌感染時(shí)提高海水青鯔存活率。
　　5.發(fā)現(xiàn)Sphistin

8、[12-38]能夠具有緩解細(xì)菌引起的炎癥反應(yīng)。將Sphistin[12-38]與溫和氣單胞菌混合后共注射海水青鳉，在注射后48h內(nèi)，海水青鳉肝臟內(nèi)免疫基因表達(dá)量相對(duì)于健康的海水青鳉有明顯上調(diào);相對(duì)于單獨(dú)注射溫和氣單胞菌的海水青鳉則有顯著下調(diào)(P＜0.05)，表明Sphistin[12-38]對(duì)溫和氣單胞菌感染海水青鳉引起的炎癥反應(yīng)具有緩解作用。
　　6.獲得了具有較好抗菌活性的聯(lián)合肽Scygonadin-Sphistin[12-3

9、8]真核表達(dá)產(chǎn)物。利用pPIC9K真核表達(dá)載體，構(gòu)建了聯(lián)合肽Scygonadin-Sphistin[12-38]和Scygonadin-linker-Sphistin[12-38]重組表達(dá)載體，使用畢赤酵母真核表達(dá)體系對(duì)聯(lián)合肽進(jìn)行表達(dá)。獲得了聯(lián)合肽 Scygonadin-Sphistin[12-38]和S cygonadin-linker-Sphistin[12-38]真核表達(dá)產(chǎn)物，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行抗菌活性檢測(cè)，結(jié)果表明聯(lián)合肽Scygon

10、adin-Sphistin[12-38]具有較好的抗菌活性。
　　7.探索了抗菌肽Sphistin上游調(diào)控區(qū)重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域。通過(guò)對(duì)已獲得的青蟹Histone2A的上游調(diào)控區(qū)進(jìn)行分析預(yù)測(cè)，將調(diào)控區(qū)序列分段構(gòu)建重組質(zhì)粒，利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)及鯉魚(yú)上皮瘤細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPC)對(duì)分段后的調(diào)控區(qū)序列活性進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，刪除-860bp至-756bp和-546bp至-291bp區(qū)域啟動(dòng)