miRNA-133b-204-5p對結(jié)直腸癌細胞增殖與周期的影響及其調(diào)控機制的研究.pdf

1、目的：結(jié)直腸癌(Colorectal Cancer，CRC)是嚴重危害人類健康的消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一，其發(fā)生發(fā)展與遺傳、生活方式、癌前病變等關(guān)系密切。根據(jù)2010年統(tǒng)計CRC在全球的惡性腫瘤發(fā)病率中男性居第3位，女性居第2位，而在我國CRC的發(fā)病率也呈逐年上升的態(tài)勢，且有年輕化、聚居化、地域化等特點，可見CRC已經(jīng)嚴重威脅人類的健康與發(fā)展。CRC與大多數(shù)惡性腫瘤一樣，是多基因、多因素、長時間作用的結(jié)果。目前，為了提高CRC臨床治療的

2、特異性和敏感性，CRC的發(fā)生機制以及相關(guān)標志物一直以來是CRC的研究熱點，其中非編碼RNA特別是微小RNA(microRNA，miRNA)的發(fā)現(xiàn)以及它調(diào)控基因表達的研究則為CRC發(fā)病機制研究和靶向治療提供了新的觀點和思路。
　　miRNA是一類長度約22個核苷酸的非編碼RNA單鏈結(jié)構(gòu)，廣泛存在于動植物體內(nèi)，可通過與其靶基因的3’端非翻譯區(qū)(3’Untranslated Region，3’UTR)結(jié)合，完成轉(zhuǎn)錄后水平的基因調(diào)控。每一

3、種miRNA都有能與之特異結(jié)合的靶基因，并且調(diào)控靶基因的表達，從而影響與靶基因相關(guān)的功能。通常一種miRNA可與多種靶基因相結(jié)合并調(diào)控其功能，多個miRNA也可共同調(diào)節(jié)同一靶基因的表達。
　　研究顯示miRNA可參與人體約3/5的基因調(diào)控，包括細胞的生長，分化，增殖，凋亡等。近年來隨著miRNA成為研究的熱點，目前多項研究表明miRNA與各類腫瘤的演進密切相關(guān)，根據(jù)其作用的不同可以發(fā)揮抑癌基因或致癌基因的作用，其中miR-133b

4、最早被認為是一種心肌特異性的miRNA，我國胡桂等在2010年研究發(fā)現(xiàn)miR-133b在結(jié)直腸癌組織及細胞系中表達下調(diào)，并與腫瘤的惡性程度有一定的相關(guān)性，但其在CRC中的作用機制尚不明確，需進一步探究。
　　miR-204是惡性腫瘤中較常見的異常表達的miRNA之一。miR-204的前體在成熟過程中會加工形成miR-204-3p和miR-204-5p兩個單鏈小分子?，F(xiàn)多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)miR-204-5p能顯著抑制腫瘤的增殖，且與腫瘤的

5、分級關(guān)系密切。但是，miR-204-5p在CRC中的研究報道甚少，其在CRC中的作用機制仍不明確，需進一步探究。
　　本實驗的前期實驗結(jié)果顯示(1)miR-133b和miR-204-5p在結(jié)直腸癌組織中的表達與癌旁正常組織相比明顯下調(diào)。(2)miR-133b和miR-204-5p在HT29細胞中表達均高于其它結(jié)直腸癌細胞系。(3)通過在線網(wǎng)站(RegRNA，MiRBase，miRanda，targetScan)篩選出可能與miR-

6、133b和miR-204-5p結(jié)合的靶基因為TGFBR1。本實驗在前期研究的基礎上(1)通過HT29細胞瞬時轉(zhuǎn)染建立高表達或抑制表達miR-133b，miR-204-5p的結(jié)直腸癌細胞系。(2)與對照組的HT29細胞系比較，觀察高表達或抑制表達miR-133b，miR-204-5p后對于HT29細胞增殖和周期的影響。(3)通過雙熒光酶素報告實驗，熒光定量PCR及Western-blot驗證前期實驗中經(jīng)篩選得出的可能與miR-133b，m

7、iR-204-5p結(jié)合的靶基因。
　　方法：
　　(1)利用陽離子脂質(zhì)體法將miR-133b/204-5p mimics及miRNA-133b/204-5p inhibitors瞬時轉(zhuǎn)染至結(jié)直腸癌細胞株HT29中，再利用CCK8和細胞周期檢測的方法檢測miR-133b，miR-204-5p轉(zhuǎn)染后對結(jié)直腸癌細胞在體外的細胞增殖與周期的影響。
　　(2)通過雙熒光酶素報告實驗，熒光定量PCR及Western-blot驗證預

8、實驗利用生物信息學在線網(wǎng)站(RegRNA, MiRBase, miRanda, targetScan)篩選出可能與miR-133b，miR-204-5p結(jié)合的靶基因。
　　(3)采用SPSS16.0對實驗所獲數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。CCK8體外增殖實驗使用析因設計的方差分析和單因素方差分析；細胞周期檢測、雙熒光酶素活性檢測、熒光定量PCR用兩獨立樣本的t檢驗，方差不齊時采用近似t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：

9、
　　(1)成功建立高表達或抑制表達的miR-133b/204-5p結(jié)直腸癌細胞系。
　　(2)CCK8法對結(jié)直腸癌HT29細胞體外增殖能力檢測結(jié)果表明與miRNA mimics NC組相比轉(zhuǎn)染miR-133b mimics組和miR-204-5p mimics組細胞增殖能力均減弱(P<0.0001，P<0.001)；與miRNA inhibitors NC組相比轉(zhuǎn)染miR-133b inhibitors組和miR-204-

10、5p inhibitors組細胞增殖能力均增強(P<0.001，P<0.001)。
　　(3)流式細胞儀分析細胞周期結(jié)果表明與miRNA mimics NC組相比轉(zhuǎn)染miR-133b mimics組G1比例增多，S期細胞比例減少。兩組細胞G1期(t=-11.24， P<0.001)，S期(t=6.117，P<0.001)，與miRNA mimics NC組相比轉(zhuǎn)染miR-204-5p mimics組G1比例增多，S期細胞比例減少。

11、兩組細胞G1期(t=-4.03，P<0.05)，S期(t=2.855，P<0.05)；與miRNA inhibitorscontrol組相比轉(zhuǎn)染miR-133b inhibitors組G1比例減少，S期細胞比例增多。兩組細胞G1期(t=4.506，P<0.05)，S期(t=-11.66，P<0.001)，與miRNA inhibitors NC組相比轉(zhuǎn)染miR-204-5p inhibitors組G1比例減少，S期細胞比例增加。兩組細胞

12、G1期(t=4.358，P<0.05)，S期(t=-9.76，P<0.001)。
　　(4)雙熒光酶素報告實驗顯示突變質(zhì)粒MUT-3′UTR與miRNA mimics NC，miR-133b mimics共轉(zhuǎn)染后其熒光素酶活性無差異(P=0.876)，突變質(zhì)粒MUT-3′UTR與 miRNA mimics NC，miR-204-5p mimics共轉(zhuǎn)染后其熒光素酶活性無差異(P=0.638)；野生型質(zhì)粒WT-3′UTR與miRNA

13、 mimics NC，miR-133b mimics共轉(zhuǎn)染后，熒光酶素活性差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，野生型質(zhì)粒 WT-3′UTR與miRNA mimics NC，miR-204-5p mimics共轉(zhuǎn)染后熒光酶素活性差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　(5)熒光定量 PCR結(jié)果表明與miRNA mimics NC組相比miR-133b mimics組TGFBR1的mRNA表達量明顯降低(t=9.78，P=0.001

14、)，與miRNA mimics NC組相比轉(zhuǎn)染miR-204-5p mimics組TGFBR1的mRNA表達量明顯降低(t=27.478，P<0.001)；與miRNA inhibitors NC組相比miR-133b inhibitors組TGFBR1的mRNA表達量明顯升高(t=-7.644，P<0.01)，與miRNA inhibitors NC組相比miR-204-5p inhibitors組TGFBR1的mRNA表達量明顯升高

15、(t=-17.605，P<0.01)。
　　(6)Western-blot結(jié)果表明與miRNA mimics NC組相比miR-133b/204-5p mimics轉(zhuǎn)染后HT29細胞中TGFBR1蛋白水平表達降低，與miRNA inhibitors NC組相比miR-133b/204-5p inhibitors轉(zhuǎn)染后TGFBR1蛋白水平表達增高。
　　結(jié)論：
　　(1)增強或抑制結(jié)直腸癌細胞中的miR-133b、miR