p55PIK在結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖中的作用及其轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分 p55PIK調(diào)控DNA合成及細(xì)胞周期進(jìn)程的Rb非依賴途徑的機(jī)制研究
　　目的：本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)在Rb陽性表達(dá)的細(xì)胞中，p55PIK能夠通過其N末端24個(gè)氨基酸（以下簡稱N24）與Rb結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞向S期進(jìn)程，干預(yù)p55PIK功能能夠使細(xì)胞周期停滯與G1/G0期，而在Rb缺失的細(xì)胞中，p55PIK也能夠調(diào)控細(xì)胞周期，但具體機(jī)制不明確。本部分研究旨在明確p55PIK在Rb缺失的

2、細(xì)胞中調(diào)控DNA合成及細(xì)胞周期進(jìn)程的作用及其Rb非依賴途徑的機(jī)制。
　　方法：首先，利用實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的高表達(dá)p55PIK的腺病毒（或轉(zhuǎn)染針對p55PIK的特異性siRNA片段），在Rb缺失的細(xì)胞（FTC236）中高表達(dá)（或者是低表達(dá)）p55PIK，通過BrdU摻入的方法檢測各組細(xì)胞 DNA的合成和細(xì)胞周期的分布，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法檢測細(xì)胞增殖；然后，構(gòu)建了裸鼠皮下移植瘤模型，檢測 p55PIK對Rb缺失的HT29（HT29Rb-

3、/-）細(xì)胞成瘤能力的影響；進(jìn)一步，通過免疫組織化學(xué)方法（Immunohistochemistry，IHC）檢測了55例臨床結(jié)直腸癌患者正常組織和腫瘤組織中p55PIK蛋白水平的表達(dá)；然后，通過免疫熒光共定位（Immunofluorescence colocalization，IFC）、免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation，IP）、pull-down等方法探討了p55PIK與細(xì)胞增殖核抗原（Proliferating

4、cell nuclear antigen，PCNA）之間的關(guān)系；最后，高表達(dá)p55PIK或利用N24干預(yù)p55PIK功能，通過定量免疫共沉淀（Quantitative co-immunoprecipitation，QIP）的方法檢測p55PIK對PCNA與DNA聚合酶δ（DNA polymeraseδ）之間結(jié)合的影響。
　　結(jié)果：過表達(dá)p55PIK能夠明顯促進(jìn)腫瘤細(xì)胞DNA的合成及細(xì)胞向S期進(jìn)程，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的增殖，而低表達(dá)p55

5、PIK能夠明顯抑制細(xì)胞DNA的合成并使細(xì)胞阻滯于S期，抑制細(xì)胞的增殖；p55PIK蛋白水平在結(jié)直腸癌腫瘤組織中呈高表達(dá)狀態(tài)，高表達(dá)p55PIK能夠促進(jìn)裸鼠皮下移植瘤的形成；p55PIK能夠通過與PCNA直接結(jié)合，促進(jìn)PCNA與DNA聚合酶δ的結(jié)合，從而促進(jìn)細(xì)胞DNA的合成，干預(yù)p55PIK的功能能夠抑制PCNA與DNA聚合酶δ的結(jié)合，從而抑制細(xì)胞DNA的合成。
　　結(jié)論：p55PIK在結(jié)直腸癌腫瘤組織中呈高表達(dá)狀態(tài)。P55PIK能

6、夠通過其N末端24個(gè)氨基酸特異性與PCNA直接結(jié)合，促進(jìn)PCNA與DNA聚合酶δ的結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞DNA的合成，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。
　　第二部分 p55PIK在結(jié)直腸癌中表達(dá)調(diào)控的轉(zhuǎn)錄后機(jī)制研究
　　目的：前期已經(jīng)證明了p55PIK在結(jié)直腸癌腫瘤中呈高表達(dá)狀態(tài)，高表達(dá)p55PIK能夠通過促進(jìn)細(xì)胞DNA的合成及細(xì)胞周期進(jìn)程促進(jìn)細(xì)胞增殖，并進(jìn)一步明確了其機(jī)制。本部分旨在探討p55PIK在結(jié)直腸癌中高表達(dá)的轉(zhuǎn)錄

7、后調(diào)控機(jī)制。
　　方法：在結(jié)直腸癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-148b的模擬物（mimics）或者是抑制子（inhibitor）通過western blot和real-time PCR方法檢測p55PIK的表達(dá)，同時(shí)通過BrdU/PI摻入法檢測其對細(xì)胞周期和DNA合成的影響，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)方法檢測其對細(xì)胞增殖的影響；構(gòu)建 miR-148b的高表達(dá)和低表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞系（LoVo細(xì)胞），并以此穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建裸鼠皮下移植瘤模型，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測miR-1

8、48b對結(jié)腸癌細(xì)胞成瘤能力及p55PIK表達(dá)的影響；構(gòu)建p55PIK的3’端非編碼區(qū)（3’Untranslated region，3’-UTR）的雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，檢測miR-148b的mimics或inhibitor對其活性的影響；突變miR-148b與p55PIK的3’-UTR結(jié)合位點(diǎn)，再檢測miR-148b對其熒光素酶報(bào)告基因活性的影響；最后，通過“rescue”實(shí)驗(yàn)檢測 miR-148b對細(xì)胞周期和 DNA合成的影響是否依

9、賴于p55PIK。
　　結(jié)果：高表達(dá)miR-148b能夠抑制p55PIK蛋白水平的表達(dá)，但對其mRNA沒有明顯影響，抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞DNA的合成，并使細(xì)胞停滯于G0/G1期；而低表達(dá)miR-148b能促進(jìn)p55PIK蛋白水平表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞DNA合成和細(xì)胞周期進(jìn)程；miR-148b能夠直接與p55PIK的3’-UTR結(jié)合，發(fā)揮對p55PIK的調(diào)控作用；體內(nèi)高表達(dá)miR-148b能夠明顯抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的成瘤能力而低表達(dá) miR-14

10、8b能夠明顯促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的成瘤能力；并能調(diào)控體內(nèi)p55PIK的表達(dá)。高表達(dá)p55PIK能夠逆轉(zhuǎn)miR-148b對結(jié)直腸癌細(xì)胞DNA合成和細(xì)胞周期調(diào)控的作用。
　　結(jié)論：miR-148b能夠通過直接作用于p55PIK的3’-UTR，抑制p55PIK蛋白水平的表達(dá)，抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞DNA的合成和細(xì)胞周期進(jìn)程，從而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和成瘤能力；miR-148b調(diào)控細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖的功能依賴于p55PIK。
　　第三部分

11、miR-148b在結(jié)直腸癌中表達(dá)調(diào)控的機(jī)制
　　目的：前面已經(jīng)明確了p55PIK在結(jié)直腸癌中對細(xì)胞增殖的作用及機(jī)制，并進(jìn)一步探討了在結(jié)直腸癌細(xì)胞中miR-148bp調(diào)控55PIK表達(dá)及功能的機(jī)制，但是，miR-148b在結(jié)直腸癌中表達(dá)調(diào)控的機(jī)制尚不明確，本部分旨在明確miR-148b在結(jié)直腸癌中表達(dá)調(diào)控的機(jī)制。
　　方法：首先，通過生物信息學(xué)分析miR-148b啟動子活性區(qū)結(jié)構(gòu)，找到調(diào)控miR-148b表達(dá)調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子p5

12、3；在結(jié)直腸癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染高表達(dá)p53的質(zhì)?；虻捅磉_(dá)p53的siRNA，通過real-time PCR方法檢測其對miR-148b表達(dá)的影響；構(gòu)建miR-148b上游啟動子活性區(qū)域的雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒質(zhì)粒，檢測p53對其活性的影響；通過點(diǎn)突變技術(shù)將p53與miR-148b可能結(jié)合的位點(diǎn)進(jìn)行突變，檢測p53對突變后的miR-148b啟動子活性區(qū)熒光素酶活性的影響；分析miR-148b啟動子上游與p53可能結(jié)合的位點(diǎn)并設(shè)計(jì)染色質(zhì)免疫共沉淀

13、（Chromatin Immunoprecipitation，Chip）引物，通過Chip方法驗(yàn)證p53與miR-148b啟動子區(qū)的關(guān)系。
　　結(jié)果：在結(jié)直腸癌中高表達(dá)p53能夠明顯促進(jìn)miR-148b的表達(dá)，低表達(dá)p53能夠明顯抑制miR-148b的表達(dá)；高表達(dá)p53能夠明顯促進(jìn)miR-148b啟動子熒光素酶報(bào)告基因活性，但對突變后的miR-148b啟動子活性卻沒有明顯影響，低表達(dá)p53能夠明顯抑制miR-148b啟動子熒光素酶

14、報(bào)告基因活性，但對突變后的miR-148b啟動子活性卻沒有明顯影響；p53能夠與miR-148b啟動子區(qū)直接結(jié)合。
　　結(jié)論：在結(jié)直腸癌細(xì)胞中，p53能夠通過與miR-148b啟動子區(qū)直接結(jié)合，增強(qiáng)miR-148b啟動子活性，促進(jìn)miR-148b的表達(dá)。
　　第四部分 p53通過miR-148b調(diào)控p55PIK的表達(dá)
　　目的：前面已經(jīng)明確了miR-148b在結(jié)直腸癌細(xì)胞中調(diào)控p55PIK的表達(dá)及具體機(jī)制，還證明了p5

15、3對miR-148b表達(dá)的調(diào)控及機(jī)制。本研究部分將探討p53能夠通過miR-148b調(diào)控p55PIK的表達(dá)。
　　方法：首先，在結(jié)直腸癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染高表達(dá)p53的質(zhì)?；虻捅磉_(dá)p53的siRNA，通過western blot和real-time PCR方法檢測了p55PIK蛋白水平和mRNA水平的表達(dá)；然后，在結(jié)直腸癌細(xì)胞中高表達(dá)p53的同時(shí)抑制miR-148b的表達(dá)，或低表達(dá)p53的同時(shí)高表達(dá)miR-148b，檢測p55PIK蛋白水

16、平的表達(dá)；進(jìn)一步，檢測了本實(shí)驗(yàn)室保存的8株結(jié)直腸癌細(xì)胞中p53、miR-148b及p55PIK的表達(dá)，觀察其是否具有相關(guān)性；最后，檢測了臨床結(jié)直腸癌患者腫瘤組織和正常組織中p53、miR-148b以及p55PIK的表達(dá)情況，明確三者在臨床樣本中的表達(dá)相關(guān)性。
　　結(jié)果：在結(jié)直腸癌細(xì)胞中高表達(dá)p53能夠抑制p55PIK蛋白水平的表達(dá)，但是對其mRNA水平卻沒有明顯的影響；低表達(dá)p53能夠明顯促進(jìn)p55PIK蛋白水平的表達(dá)，但是對其m

17、RNA水平卻沒有明顯的影響。高表達(dá)p53的同時(shí)低表達(dá)miR-148b能夠恢復(fù)p53對p55PIK蛋白水平的抑制作用，而低表達(dá)p53的同時(shí)高表達(dá)miR-148b能夠抵消p53對p55PIK蛋白水平的促進(jìn)作用；在8株結(jié)直腸癌細(xì)胞中，p55PIK高表達(dá)的細(xì)胞系，miR-148b呈低表達(dá)狀態(tài)，對應(yīng)的p53蛋白水平呈明顯低表達(dá)甚至缺失或存在功能缺失的突變；臨床樣本中，p55PIK在腫瘤組織中呈高表達(dá)狀態(tài)，而miR-148b呈低表達(dá)狀態(tài)；在新取的9