miR-133b調(diào)控CTGF表達在結(jié)直腸癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用機制研究.pdf

1、研究背景:結(jié)直腸癌是世界上高發(fā)的消化道惡性腫瘤之一，死亡率高。我國結(jié)直腸癌發(fā)病率逐年上升，嚴重影響生活質(zhì)量，危害人們的生命健康。結(jié)直腸癌致病致死的主要原因是腫瘤的轉(zhuǎn)移，而腫瘤細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵所在。EMT是指具有上皮表型的細胞在多種生理或病理因素的刺激下，上皮結(jié)構(gòu)消失，失去細胞極性和緊密連接，表現(xiàn)為細胞內(nèi)骨架成分重排并獲得移行能力等間質(zhì)細胞的

2、特性，轉(zhuǎn)化為間質(zhì)表型細胞的現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)，EMT現(xiàn)象在多種惡性腫瘤的侵襲和遠處轉(zhuǎn)移中存在，說明兩者有著密切的聯(lián)系。microRNA(miRNA)是一類內(nèi)源性并且高度保守的非編碼小分子RNA，大小約22個核苷酸左右，通過與靶基因mRNA3'-UTR的堿基互補配對后，抑制mRNA翻譯過程或促進mRNA的降解，能抑制靶基因在轉(zhuǎn)錄后水平的表達，從而調(diào)控基因發(fā)揮生物功能。目前對miRNA的生物學(xué)功能眾說紛紜，研究主要集中在miRNA調(diào)節(jié)生物體生長

3、、發(fā)育、細胞分化、凋亡及腫瘤形成等眾多方面，尤其在某些惡性腫瘤當(dāng)中，miRNA可以調(diào)控不同的靶基因的特性，使得其能夠來充當(dāng)類似于原癌或抑癌基因的角色。最近的研究結(jié)果證實，miRNA-133 b(miR-133b)的表達異常是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，對腫瘤形成有促進作用，miR-133b在結(jié)腸癌中的差異表達已經(jīng)被報道，但是其在結(jié)直腸癌中致癌、腫瘤轉(zhuǎn)移機制及作用尚未完全明確。
　　方法:本研究小組前期研究已經(jīng)證實，miR-133b是一

4、種新發(fā)現(xiàn)的在結(jié)直腸癌中具有抑瘤作用的miRNA，但仍有許多關(guān)鍵的問題沒有得到解答，需進一步深入研究。本課題在前期工作的基礎(chǔ)上，擬開展研究工作如下:1）通過靶點驗證及細胞功能驗證，對miR-133b在結(jié)直腸癌中的作用靶點進行系統(tǒng)分析和深入的研究，有望闡明miR-133b在結(jié)直腸癌中的作用機理;2）通過在結(jié)直腸癌標(biāo)本中檢測miR-133b及其靶基因的表達特征，分析miR-133b與結(jié)直腸癌各病理指標(biāo)及臨床指標(biāo)之間的關(guān)系;3）通過結(jié)直腸癌EM

5、T過程中的分子調(diào)控機制分析結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的可能原因。
　　實驗結(jié)果:
　　1.miR-133b與CTGF在結(jié)直腸癌中的靶點驗證
　　生物信息學(xué)預(yù)測及基因芯片結(jié)果提示miR-133b的潛在靶基因參與TGF-β和Colorectal cancer pathway等通路。綜合分析數(shù)據(jù)并進一步選擇CTGF基因進行驗證。實時熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測SW620、HT29細胞轉(zhuǎn)染miR-133b過表達模擬物(m

6、imics)和抑制表達載體(inhibitor)后靶基因的表達。結(jié)果初步提示miR-133b靶基因為CTGF。雙熒光素酶實驗:構(gòu)建了含CTGF與miR-133b結(jié)合位點序列及其缺失突變型的pYr-Mir載體，運用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炦M行分析，結(jié)果提示:CTGF是miR-133b調(diào)控的靶基因。Western-blot證實轉(zhuǎn)染miR-133b前后CTGF蛋白表達下調(diào)，表明:CTGF受miR-133b的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。
　　2.miR-1

7、33b與CTGF在結(jié)直腸癌中的表達及臨床病理特征相關(guān)性分析
　　實時熒光定量PCR檢測71對癌組織及癌旁組織樣本中miR-133b的表達。結(jié)果顯示:在66例癌組織樣本中，miR-133b表達與配對癌旁組織相比明顯下調(diào)，僅5例癌組織樣本中miR-133b表達升高，存在顯著性差異;CTGF在結(jié)直腸癌、癌旁組織中的免疫組化結(jié)果顯示:結(jié)直腸癌組織中CTGF蛋白表達陽性率相比配對癌旁組織明顯升高，存在顯著性差異。Real-time PCR及

8、免疫組化結(jié)果顯示，miR-133b及CTGF的陽性表達與TNM分期以及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，與年齡、性別、分化程度、腫瘤大小和遠處轉(zhuǎn)移無關(guān)。
　　3.miR-133b調(diào)控結(jié)直腸癌EMT過程的分子機制分析
　　細胞轉(zhuǎn)染miR-133b質(zhì)粒后，細胞形態(tài)由紡錘形向類圓形改變，E-cadherin免疫熒光強度增強，vimentin免疫熒光強度減弱;RT-PCR和Western blot證實代表上皮細胞表型的E-cadherin表達水平

9、升高，代表間質(zhì)細胞表型的vimentin表達水平下降;Transwell實驗證實轉(zhuǎn)染miR-133b質(zhì)粒后CRC細胞的侵襲和遷移能力均下降。共轉(zhuǎn)染miR-133b與CTGF過表達質(zhì)粒后，E-cadherin免疫熒光強度減弱，vimentin免疫熒光強度增強;RT-PCR和Western blot證實代表上皮細胞表型的E-cadherin表達水平下降，代表間質(zhì)細胞表型的vimentin表達水平上升;Transwell實驗證實共轉(zhuǎn)染后CRC

10、細胞的侵襲和遷移能力均上升。跟正常結(jié)直腸組織相比，結(jié)直腸癌組織中E-cadherin表達水平明顯下降，CTGF及vimentin表達水平明顯升高;組織中CTGF蛋白表達水平與E-cadherin呈負相關(guān)性，與vimentin呈正相關(guān)性;CTGF表達水平與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目、臨床進展等臨床病理特征密切相關(guān)。
　　結(jié)論:
　　1.miR-133b在結(jié)直腸癌中是一種抑癌基因，可通過抑制靶基因CTGF達到抑制腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移的效應(yīng)。<