IGFBP-rP1在結(jié)直腸癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、結(jié)直腸癌是一類嚴(yán)重威脅人類健康和生存的惡性腫瘤，從世界范圍看，結(jié)直腸癌的發(fā)病率居男性惡性腫瘤的第三位，女性第二位。在我國(guó)，隨著居民生活方式和膳食結(jié)構(gòu)的改變，以及人口老齡化進(jìn)程的加快，結(jié)直腸癌的發(fā)病率上升趨勢(shì)明顯。盡管近年來結(jié)直腸癌的早期診斷及治療手段取得了一定的進(jìn)步，但中晚期結(jié)直腸癌患者生存率并沒有得到實(shí)質(zhì)性改善，而轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。因此，積極開展對(duì)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究，尋找新的關(guān)鍵分子和治療靶點(diǎn)，對(duì)結(jié)直腸癌的干預(yù)和

2、治療具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
　　上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)是一種基本的生理病理現(xiàn)象，最早在胚胎發(fā)育的相關(guān)研究領(lǐng)域中提出。一般認(rèn)為EMT是指上皮細(xì)胞在特定的生理和病理情況下向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，在這個(gè)過程中，上皮細(xì)胞失去極性，細(xì)胞間連接消失，上皮標(biāo)記物表達(dá)下調(diào)或缺失，而逐漸獲得間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)特征及相關(guān)標(biāo)記物，并且細(xì)胞的遷移侵襲能力增強(qiáng)，EMT也可使細(xì)胞獲得一些干細(xì)胞的生物學(xué)

3、特性，抵抗凋亡和衰老。同時(shí)，在一定的條件下，具有間質(zhì)表型的腫瘤細(xì)胞又可轉(zhuǎn)化為具有上皮表型特征的腫瘤細(xì)胞，即間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化(Mesenchymal-Epithelial Transition，MET)。從結(jié)直腸癌經(jīng)典形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，在腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移過程中存在形態(tài)學(xué)的可逆性變化，免疫組織化學(xué)標(biāo)記和分子生物學(xué)研究證明，結(jié)直腸癌細(xì)胞存在EMT和MET的過程。在20-40％的結(jié)直腸癌組織中所觀察到的腫瘤芽被認(rèn)為是EMT在結(jié)直腸癌組織形態(tài)上的表現(xiàn)。目前

4、普遍認(rèn)為EMT在結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用。有關(guān)EMT發(fā)生的分子機(jī)制及其復(fù)雜，細(xì)胞內(nèi)外的多種分子和信號(hào)通路參與其中。一些生長(zhǎng)因子如TGF-β、FGF、EGF、IGF、HGF、PDGF等通過自分泌或旁分泌的方式，激活胞內(nèi)不同的信號(hào)通路，各種信號(hào)通路相互交錯(cuò)形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控著EMT的發(fā)生。其中，TGF-β信號(hào)通路研究的最為充分詳盡。TGF-β是目前最為常用的EMT誘導(dǎo)因子，在體外實(shí)驗(yàn)中，大多數(shù)學(xué)者采用TGF-β作為誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生E

5、MT的重要手段。
　　胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-相關(guān)蛋白1(insulin-like growth factor bindingprotein-related protein1，IGFBP-rP1)也稱為IGFBP7，與傳統(tǒng)的IGFBP1-6不同，其與IGF結(jié)合能力較低，而與胰島素的結(jié)合能力較強(qiáng)，因此，IGFBP-rP1可能具有不同于傳統(tǒng)IGFBP家族成員的新的生物學(xué)功能。IGFBP-rP1在不同實(shí)驗(yàn)室通過不同的差減文庫(kù)被篩選到，

6、由于其來源及功能的不同，具有多個(gè)不同的命名。我們實(shí)驗(yàn)室自從應(yīng)用抑制性差減雜交法篩選出IGFBP-rP1后，一直致力于其生物學(xué)效應(yīng)和分子機(jī)制的研究。我們發(fā)現(xiàn)，IGFBP-rP1的過表達(dá)可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，降低其軟瓊脂克隆形成能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和衰老，在結(jié)直腸癌中發(fā)揮著潛在的抑癌作用，這在肺癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌等腫瘤細(xì)胞中也得到了驗(yàn)證。最近一些體內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)，IGFBP-rP1可影響細(xì)胞的遷移侵襲能力，我們前期實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)在結(jié)直

7、腸癌細(xì)胞中采用去甲基化藥物5-aza-dC處理恢復(fù)IGFBP-rP1的表達(dá)后，細(xì)胞的遷移侵襲能力減弱。因此，本課題的目的是明確IGFBP-rP1在結(jié)直腸癌細(xì)胞EMT中的作用，并探討相關(guān)的分子機(jī)制。
　　我們?cè)诓煌臒o內(nèi)源性表達(dá)IGFBP-rP1的結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620、CW2及HT29中分別建立了穩(wěn)定表達(dá)IGFBP-rP1的單克隆細(xì)胞株，通過Western blot、 Real-timeRT-PCR、細(xì)胞免疫熒光、細(xì)胞劃痕以及Tr

8、answell小室等方法，分析IGFBP-rP1對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞EMT的影響。我們發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌細(xì)胞中過表達(dá)IGFBP-rP1后可上調(diào)上皮標(biāo)記物E-cadherin的表達(dá)，其主要分布在細(xì)胞膜及細(xì)胞漿;而間質(zhì)標(biāo)記物N-cadherin，vimentin，MMP9的表達(dá)均有不同程度的下調(diào)，EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子ZEB1和Snail的表達(dá)也顯著降低。細(xì)胞劃痕和Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)顯示IGFBP-rP1過表達(dá)可顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移能

9、力。在無內(nèi)源性表達(dá)IGFBP-rP1的結(jié)直腸癌細(xì)胞中外源性加入IGFBP-rP1重組蛋白(rhIGFBP-rP1)也可以觀察到與轉(zhuǎn)染相似的結(jié)果，rhIGFBP-rP1可細(xì)微上調(diào)上皮標(biāo)記物的表達(dá)，而下調(diào)間質(zhì)標(biāo)記物的表達(dá)。由此可見，在結(jié)直腸癌細(xì)胞中過表達(dá)IGFBP-rP1可抑制EMT過程，也進(jìn)一步說明IGFBP-rP1可通過自分泌或旁分泌途徑而發(fā)揮作用。
　　我們進(jìn)一步選取IGFBP-rP1表達(dá)陽(yáng)性的結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480，采用shR

10、NA干擾的方法沉默IGFBP-rP1的表達(dá)，進(jìn)一步分析IGFBP-rP1與EMT的關(guān)系。我們從上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司訂購(gòu)了pGPU6/GFP/Neo shRNA Expression Vector Kit，采用Lipofectamine2000試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，通過RT-PCR和Western blot的方法對(duì)干擾效果進(jìn)行驗(yàn)證，并篩選到穩(wěn)定干擾IGFBP-rP1的單克隆細(xì)胞株，我們選取兩個(gè)單克隆進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。Western blot結(jié)果

11、顯示，在SW480細(xì)胞中沉默IGFBP-rP1的表達(dá)后可顯著下調(diào)上皮標(biāo)記物ZO-1的表達(dá)，上調(diào)間質(zhì)標(biāo)記物N-cadherin，vimentin及MMP9的表達(dá)。另外，EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子ZEB1和Snail的表達(dá)在IGFBP-rP1沉默之后也有不同程度的增加。細(xì)胞劃痕和Transwell小室實(shí)驗(yàn)也證明，在SW480細(xì)胞中沉默IGFBP-rP1表達(dá)后可顯著增強(qiáng)細(xì)胞的遷移侵襲能力。以上結(jié)果說明，在結(jié)直腸癌細(xì)胞中沉默IGFBP-rP1表達(dá)可促進(jìn)

12、EMT的發(fā)生。另外，我們?cè)诜€(wěn)定干擾IGFBP-rP1的單克隆細(xì)胞株中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)載體PcDNA3.1(IGFBP-rP1)或外源性加入rhIGFBP-rP1，觀察恢復(fù)IGFBP-rP1表達(dá)是否可以逆轉(zhuǎn)其沉默所誘導(dǎo)的EMT過程。我們發(fā)現(xiàn)恢復(fù)IGFBP-rP1表達(dá)后可逆轉(zhuǎn)IGFBP-rP1沉默所引起的EMT標(biāo)記物的表達(dá)變化及細(xì)胞遷移能力的增加，進(jìn)一步證明IGFBP-rP1可阻止EMT的發(fā)生。
　　復(fù)雜的EMT過程也會(huì)涉及細(xì)胞骨架的變化

13、，我們采用熒光素標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽對(duì)細(xì)胞染色，在激光掃描共聚焦顯微鏡下直接觀察IGFBP-rP1過表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞骨架(F-actin)的影響。結(jié)果顯示，在原始SW620細(xì)胞中，F(xiàn)-actin排列紊亂，無規(guī)則，在細(xì)胞周邊有明顯的板狀及絲狀偽足伸出;空載體對(duì)照細(xì)胞中也觀察到類似現(xiàn)象，而在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染過表達(dá)IGFBP-rP1的細(xì)胞中，F(xiàn)-actin排列規(guī)則，細(xì)胞周圍無明顯偽足形成，這與轉(zhuǎn)染細(xì)胞株較弱的遷移能力是相一致的。
　　TGF-β1是

14、最常用的EMT誘導(dǎo)因子，我們以10ng/ml TGF-β1刺激HT29細(xì)胞之后，TGF-β/Smad信號(hào)通路激活，Smad2/3的磷酸化水平明顯增加，HT29細(xì)胞在TGF-β1處理之后也出現(xiàn)EMT特征，間質(zhì)標(biāo)記物表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞遷移能力增加。而外源性加入rhIGFBP-rP1則可逆轉(zhuǎn)TGF-β1所誘導(dǎo)的EMT現(xiàn)象，進(jìn)一步說明IGFBP-rP1在結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)生EMT的過程中發(fā)揮著抑制作用。同時(shí)，rhIGFBP-rP1可抑制TGF-β/Sm

15、ad信號(hào)通路的活性，p-Smad2/3水平明顯降低。在結(jié)直腸癌細(xì)胞中過表達(dá)IGFBP-rP1可下調(diào)Smad2的磷酸化水平，而沉默IGFBP-rP1后則可上調(diào)Smad2的磷酸化水平，這均提示IGFBP-rP1可能通過影響TGF-β/Smad信號(hào)通路發(fā)揮作用。
　　我們也初步分析了IGFBP-rP1對(duì)Wnt干言號(hào)通路的影響。首先檢測(cè)了Wnt信號(hào)通路中的關(guān)鍵因子β-catenin，發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌細(xì)胞中過表達(dá)或沉默IGFBP-rP1并不影

16、響β-catenin在mRNA及蛋白水平上的表達(dá)變化，且Wnt信號(hào)通路下游靶基因c-myc、cyclinD1及survivin也未見明顯改變，可見IGFBP-rP1對(duì)Wnt信號(hào)通路并無顯著影響。然而采用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察β-catenin在細(xì)胞中定位情況發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)IGFBP-rP1后可明顯減少β-catenin在細(xì)胞核中的分布，提取胞核蛋白，采用Westernblot檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)過表達(dá)IGFBP-rP1可減少β-catenin在胞

17、核中的表達(dá)。雖然IGFBP-rP1對(duì)β-catenin的表達(dá)水平?jīng)]有顯著影響，但其可能通過某些機(jī)制影響β-catenin在細(xì)胞中的分布，利于其粘附功能的發(fā)揮而維持上皮細(xì)胞表型。
　　綜合上述研究結(jié)果，我們得出以下結(jié)論:
　　1.在結(jié)直腸癌細(xì)胞中，IGFBP-rP1誘導(dǎo)上皮標(biāo)記物的表達(dá)，下調(diào)間質(zhì)標(biāo)記物的表達(dá)，同時(shí)降低細(xì)胞的遷移侵襲能力，在EMT過程中發(fā)揮抑制作用。
　　2.在結(jié)直腸癌細(xì)胞中，IGFBP-rP1可能通過影響