MicroRNA-133b在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中靶基因的篩選.pdf

1、結(jié)直腸癌(Colorectal carcinoma，CRC)是常見的消化道惡性腫瘤之一，全球CRC的發(fā)病率均呈上升趨勢。CRC的發(fā)生發(fā)展過程與眾多腫瘤相關(guān)因子的異常表達(dá)及功能改變有關(guān)。
　　miRNA是一類內(nèi)源性的非編碼單鏈RNA，由22個左右核苷酸組成，其靶向抑制mRNA的翻譯或直接將其降解，使靶基因在轉(zhuǎn)錄后水平的表達(dá)受到抑制，從而起到基因表達(dá)的調(diào)控作用[1]。2003年，Michael等[2]最早報道了miRNA在人結(jié)直腸癌組

2、織和正常結(jié)直腸黏膜中的差異表達(dá)，檢測到28種miRNAs表達(dá)發(fā)生了變化，其中miR-143和miR-145在癌組織中表達(dá)較正常組織明顯降低。隨后的研究發(fā)現(xiàn)眾多miRNA參與了CRC的發(fā)生發(fā)展過程，并與CRC的診斷、分期、治療與預(yù)后等密切相關(guān)[3，4]。miRNA通過調(diào)控不同的靶基因在腫瘤中起到類似于原癌基因或抑癌基因的作用[5]。miR-133b最初被認(rèn)為是一種心肌特異性的miRNA，在心肌的發(fā)育和功能維持方面起重要作用[6，7]。近年

3、有研究小組幾乎同時發(fā)現(xiàn)miR-133b在肺癌[8]、食道癌[9]、舌癌[10]、胃癌[11]、膀胱癌[12]等不同腫瘤中表達(dá)失調(diào)，并具有明確的腫瘤抑制效應(yīng)。胡桂等[13，14]首次通過研究證實了miR-133b在結(jié)直腸癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)明顯下調(diào)，且與結(jié)直腸癌細(xì)胞的惡性程度密切相關(guān);功能實驗進(jìn)一步證實miR-133b可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲和遷移，并具有明顯的細(xì)胞周期阻滯的作用;動物實驗發(fā)現(xiàn)在裸鼠體內(nèi)同樣有明確的腫瘤抑制作用。盡管如此

4、，miR-133b在CRC中的作用機(jī)制仍不明確，需進(jìn)行進(jìn)一步研究。
　　研究目的:本實驗在前期實驗的基礎(chǔ)上，通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染建立miR-133b高表達(dá)的結(jié)直腸癌細(xì)胞系，并與未轉(zhuǎn)染的結(jié)直腸癌細(xì)胞對比進(jìn)行基因芯片高通量測序及基因的功能注釋，篩選出miR-133b在CRC中可能相關(guān)的靶基因。
　　材料與方法:本研究選用兩種購自ATCC細(xì)胞庫的結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW620及HT29，將細(xì)胞分成4組進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。實驗分組為miR-133b m

5、imics轉(zhuǎn)染組(用Lipofectamine2000即Lipo2000轉(zhuǎn)染miR-133b mimics)，NC轉(zhuǎn)染組(用Lipo2000轉(zhuǎn)染miR negativecontrol)，空白組(Blank，加入與前2組等量的Lipo2000，無miRNA片段)，對照組（Control，細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，不加入Lipo2000和miRNA片段）。將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞進(jìn)行倒置熒光顯微鏡下的熒光顯色情況觀察，并采用real-time PCR的方式檢測各組

6、細(xì)胞中miR-133b的表達(dá)情況，評價其轉(zhuǎn)染效率。將成功轉(zhuǎn)染了miR-133b mimics的兩種細(xì)胞分別與相應(yīng)細(xì)胞的NC轉(zhuǎn)染組配對進(jìn)行Agilent人全基因表達(dá)譜芯片的高通量測序。檢測出的差異基因初步根據(jù)基因在miR-133b組中表達(dá)下調(diào)、P＜0.05、FC(abs)≥1.5這幾個條件進(jìn)行篩選，然后進(jìn)一步與miRNA靶基因預(yù)測軟件（miRBase，PicTar，TargetScan）進(jìn)行比對，最終篩選出的基因行GO分子功能和Pathw

7、ay信號通路富集度統(tǒng)計分析。
　　結(jié)果:
　　1.轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌細(xì)胞系后miR-133b表達(dá)的檢測
　　miR-133b mimics轉(zhuǎn)染CRC細(xì)胞系SW620及HT29的最佳濃度為80nM，轉(zhuǎn)染效率可達(dá)50％左右。通過Real-time PCR法檢測miR-133bmimics轉(zhuǎn)染組，NC轉(zhuǎn)染組，空白組及對照組中miR-133b的相對表達(dá)率(RQ)。以對照組中miR-133b相對表達(dá)率為1，以RQ=2-ΔΔCT為公式計

8、算其他各組的RQ值，在SW620細(xì)胞系中，miR-133b mimics轉(zhuǎn)染組miR-133b的表達(dá)(502.461±16.837)顯著上調(diào)(P=0.000563);NC轉(zhuǎn)染組miR-133b的表達(dá)(0.841±0.305)無明顯改變(P=0.537648);空白組miR-133b的表達(dá)(0.803±0.284)無明顯改變(P=0.431831); NC轉(zhuǎn)染組與空白組比較miR-133b的表達(dá)無明顯差異(P=0.910242)。在HT2

9、9細(xì)胞系中，miR-133b mimics轉(zhuǎn)染組miR-133b的表達(dá)(332.386±13.039)顯著上調(diào)(P=0.000773); NC轉(zhuǎn)染組miR-133b的表達(dá)(0.870±0.219)無明顯改變(P=0.490357);空白組miR-133b的表達(dá)(0.767±0.356)無明顯改變(P=0.451923);NC轉(zhuǎn)染組與空白組比較miR-133b的表達(dá)無明顯差異(P=0.807844)。
　　2.人全基因表達(dá)譜篩選靶基

10、因的分析
　　運(yùn)用Agilent人全基因表達(dá)譜芯片標(biāo)記出的差異基因數(shù)，SW620細(xì)胞系為34364個，HT29細(xì)胞系為39443個。符合在miR-133b組中表達(dá)下調(diào)、P＜0.05、FC(abs)≥1.5這幾個標(biāo)準(zhǔn)的差異基因數(shù)，SW620細(xì)胞系有346個，HT29細(xì)胞系有354個。運(yùn)用三種不同的microRNA靶點預(yù)測軟件（miRBase，PicTar，TargetScan）最終篩選出9個相關(guān)靶基因，SW620細(xì)胞系有7個靶基因:

11、latent transforming growth factorbeta binding protein1(NM_206943),contactin associated protein1(NM_003632), human immunodeficiency virus type I enhancer bindingprotein2(NM_006734),dual specificity phosphatase5(NM_004419)

12、,connective tissue growth factor(NM_001901),yippee-like2(Drosophila)(NM_001005404),GABA(A) receptor-associated protein like1(NM_031412)。HT29細(xì)胞系有2個靶基因:family with sequencesimilarity19(chemokine(C-C motif)-like), member A5

13、(NM_015381),beta-1,3-N-acetylgalactosaminyltransferase1(globoside blood group)（NM_001038628）。
　　將以上9個靶基因經(jīng)分子功能注釋系統(tǒng)(Molecule AnnotationSystem，MAS3.0)進(jìn)行相應(yīng)的GO分子功能和Pathway信號通路富集度統(tǒng)計分析。B3GALNT1主要定位在高爾基體膜上，與鎂離子結(jié)合有關(guān)，參與部分糖蛋白的代謝

14、過程，并有轉(zhuǎn)移酶活性。CNTNAP1主要定位于細(xì)胞膜上，為一種細(xì)胞粘附分子，有受體活性，有信號傳導(dǎo)功能，并與SH2/SH3結(jié)合有關(guān)。CTGF主要定位于細(xì)胞膜上或細(xì)胞間質(zhì)中，是一種生長因子，與整合素、胰島素樣生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子等信號通路有關(guān)，還與細(xì)胞形態(tài)、運(yùn)動、粘附、遷移、分化，表皮生長，組織形成，血管生成，骨化、軟骨縮合等多種生物學(xué)過程有關(guān)。DUSP5定位于細(xì)胞核，主要參與氨基酸去磷酸化，還有酪氨酸磷酸酶、MAPK磷酸酶、水解

15、酶等活性，并與MAPK信號通路有關(guān)。GABARAPL1在細(xì)胞內(nèi)各處均存在，能調(diào)節(jié)自噬作用，與蛋白結(jié)合，如GABA受體、β-微管蛋白等。HIVEP2主要定位于細(xì)胞核上，與DNA連接，金屬離子的結(jié)合有關(guān)，調(diào)控轉(zhuǎn)錄過程。LTBP1定位于細(xì)胞間質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核上，與鈣離子、生長因子等結(jié)合有關(guān)，有TGF-β受體活性，并參與其信號通路。FAM19A5主要定位于細(xì)胞間質(zhì)或者細(xì)胞膜上，YPEL2主要定位于細(xì)胞核上。
　　結(jié)論:1.miR-133