MiRNA-300對(duì)結(jié)直腸癌腫瘤侵襲和增殖的影響及其調(diào)控機(jī)制的初步研究.pdf

1、背景及目的：
　　結(jié)直腸癌（Colorectal cancer，CRC）是人體非常常見(jiàn)的惡性腫瘤，其中又分為結(jié)腸癌和直腸癌。結(jié)直腸癌根據(jù)發(fā)病部位其發(fā)病率有很大的不同，從高到低依次為直腸、乙狀結(jié)腸、盲腸、升結(jié)腸、降結(jié)腸及橫結(jié)腸，近年有向近端（右半結(jié)腸）發(fā)展的趨勢(shì)。其發(fā)病與生活方式、遺傳、大腸腺瘤等各方面關(guān)系密切。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，除了少部分結(jié)直腸癌患者有著明顯的家族性發(fā)病傾向以外，絕大多數(shù)的患者屬于散發(fā)性結(jié)直腸癌患者，發(fā)病的原因多與個(gè)

2、體基因突變有關(guān)，其中包括有染色體突變、DNA錯(cuò)配修復(fù)等等不同的類(lèi)型，目前關(guān)于結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制研究并沒(méi)有十分透徹，其發(fā)病途徑大體可分為三類(lèi)，但其中每種途徑的具體分子機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。
　　除了原發(fā)病灶以外，結(jié)直腸癌的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移也是危害人體健康的重要因素。結(jié)直腸癌最常見(jiàn)的浸潤(rùn)形式是局部侵犯，腫瘤通過(guò)種植轉(zhuǎn)移逐步浸潤(rùn)周?chē)M織或器官，造成相應(yīng)的臨床癥狀?；颊咭坏┏霈F(xiàn)肛門(mén)失禁、下腹及腰骶部持續(xù)疼痛，則是直腸癌侵及骶神經(jīng)叢所致。腫瘤細(xì)胞

3、種植轉(zhuǎn)移到腹腔、盆腔，形成相應(yīng)的癥狀和體征，直腸指檢可在膀胱直腸窩或子宮直腸窩內(nèi)捫及塊物，腫瘤在腹盆腔內(nèi)廣泛種植轉(zhuǎn)移，形成腹腔積液。結(jié)直腸癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移主要有兩種方式：淋巴轉(zhuǎn)移和血行轉(zhuǎn)移。腫瘤細(xì)胞通過(guò)淋巴管轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)，也可通過(guò)血行轉(zhuǎn)移至肝臟、肺部、骨等部位。目前來(lái)講，結(jié)直腸癌最常見(jiàn)的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移，這也是危害最大的途徑，約50％的患者會(huì)出現(xiàn)術(shù)前或者術(shù)后的結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移，其中，又有30%的病人在手術(shù)前已經(jīng)有 B超或者CT無(wú)法檢測(cè)

4、到的隱匿性肝轉(zhuǎn)移。結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移灶采取切除術(shù)是比較安全的，也是目前提高已經(jīng)發(fā)生結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的患者的最優(yōu)治療方案，但遺憾的是，只有10%-20%的結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者適合手術(shù)切除治療，且其中70%的病人會(huì)出現(xiàn)病后復(fù)發(fā)。
　　作為一種多基因突變導(dǎo)致的惡性癌癥，結(jié)直腸癌有著非常復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制，目前為止，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有幾種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展有著極其密切的聯(lián)系，其中包括Wnt/β-catenin途徑、Ras途徑、p53途徑等等

5、，而在這些途徑中，p53途徑作為最經(jīng)典的抑癌基因，被人們研究的也最多，但是經(jīng)臨床研究發(fā)現(xiàn)，那些因?yàn)閜53變異而導(dǎo)致結(jié)直腸癌的患者對(duì)于目前的治療手段有著明顯的抵抗力，而且即使通過(guò)相應(yīng)治療得到好轉(zhuǎn)，其預(yù)后也相對(duì)較差。雖然其機(jī)制還并不是十分清楚，但是并不妨礙人們將p53作為試圖研究結(jié)直腸癌的突破口。
　　所有腫瘤組織細(xì)胞中，p53異常的數(shù)量超過(guò)了50%，在最初的發(fā)現(xiàn)中，p53是作為一個(gè)抑癌基因所出現(xiàn)，在細(xì)胞增殖生長(zhǎng)周期中，p53起著極其

6、重要的調(diào)控作用，它可以暫時(shí)性的暫停細(xì)胞周期的進(jìn)程，以給與損傷DNA修復(fù)的時(shí)間，也可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，防止細(xì)胞無(wú)限制增長(zhǎng)現(xiàn)象的出現(xiàn)，還可以永久的終結(jié)一些不停進(jìn)行細(xì)胞分裂的癌變細(xì)胞?？梢粤私獾?，一個(gè)人體內(nèi)細(xì)胞如果出現(xiàn)癌變，細(xì)胞中功能正常的p53就會(huì)立即停止該癌變細(xì)胞的分裂分化，而一旦人體內(nèi)癌癥細(xì)胞中的p53出現(xiàn)異常，就會(huì)導(dǎo)致該細(xì)胞無(wú)限制的繁殖，出現(xiàn)整個(gè)組織的癌變。在1989年報(bào)道中，第一次發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌細(xì)胞中的p53出現(xiàn)了突變，至今已經(jīng)有超過(guò)8

7、00篇文獻(xiàn)研究過(guò)這個(gè)問(wèn)題，其中就有報(bào)道稱(chēng)，在體內(nèi)，野生型的p53可以抑制結(jié)直腸癌腫瘤的發(fā)生發(fā)展。
　　MicroRNA（MiRNA）是一種有內(nèi)源基因編碼的、長(zhǎng)度大概為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，在動(dòng)植物體內(nèi)廣泛存在，主要參與了生物體內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控作用，目前為止，文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)的人類(lèi)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的RNA分子個(gè)數(shù)為28645個(gè)。MicroRNA（MiRNA）是屬于小RNA的一種，在組織細(xì)胞中起著極其重要的調(diào)控作用，每個(gè)MiRNA都有自

8、己特定的靶基因，通?？梢砸粋€(gè)MiRNA調(diào)控多個(gè)基因，也可以幾個(gè)MiRNA調(diào)控同一個(gè)基因，從而在人體內(nèi)形成了一個(gè)復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
　　結(jié)直腸癌細(xì)胞中存在著MiRNA異常表達(dá)的研究起始于2003年，Michael等報(bào)道，與正常粘膜組織對(duì)比，結(jié)直腸癌腺瘤和腺瘤階段的組織中都存在著MiRNA-143的表達(dá)恒定下調(diào)。目前研究已經(jīng)肯定多種MiRNA的異常表達(dá)與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)，有些MiRNA分子在發(fā)病過(guò)程中起著致癌基因的作用

9、，如MiRNA-21、MiRNA-17-92等在結(jié)直腸癌細(xì)胞中表達(dá)明顯增高，并分別通過(guò)抑制靶基因PDCD4、SPRY2和E2F1等的表達(dá)促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，另一些MiRNA分子則起著抑癌基因的作用并在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)下調(diào)，如MiRNA-143、MiRNA-145和MiRNA-200等，這些MiRNA對(duì)靶基因的K-ras、ERK5和ZEB1等表達(dá)的抑制減弱在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。
　　MiRNA-300是一個(gè)高度保守的M

10、iRNA，最初被認(rèn)為是一個(gè)特異性的調(diào)控造血祖細(xì)胞增殖及粒系分化的MiRNA。目前對(duì)MiRNA-300的表達(dá)研究在血液性疾病中較多，例如，在急性粒細(xì)胞白血病中，MiRNA-300的表達(dá)明顯下調(diào)；MiRNA-300在慢性淋巴細(xì)胞性白血病中表達(dá)下調(diào)；MiRNA-300調(diào)控粒細(xì)胞的增殖和分化；在髓外細(xì)胞瘤中MiRNA-300的表達(dá)缺失。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，MiRNA-300在肝細(xì)胞癌、原發(fā)性的小細(xì)胞性肺癌中表達(dá)下調(diào)；而在食管鱗狀細(xì)胞癌、肝內(nèi)膽管細(xì)

11、胞癌、膀胱癌及胃癌中表達(dá)上調(diào)。由此可見(jiàn)，MiRNA-300與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展可能存在一定的聯(lián)系。
　　由于MiRNA-300是一類(lèi)新發(fā)現(xiàn)的MiRNA，所以目前對(duì)其研究較少，之前的文獻(xiàn)對(duì)于MiRNA-300與腫瘤的關(guān)系的報(bào)道更多的集中在血液病中，且對(duì)于其分子機(jī)制并沒(méi)有進(jìn)行深入的研究，本研究的主要目的是通過(guò)發(fā)現(xiàn)MiRNA-300在結(jié)直腸癌細(xì)胞中表達(dá)水平的變化，并對(duì)其進(jìn)行深入的研究，來(lái)探究MiRNA-300在結(jié)直腸癌中的作用機(jī)理。

12、>　　主要擬解決的問(wèn)題是：1，在結(jié)直腸癌組織細(xì)胞中以及結(jié)直腸癌細(xì)胞系中，是否存在MiRNA-300表達(dá)水平的改變；2，MiRNA-300對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞是否有著明顯的作用；3，通過(guò)把經(jīng)過(guò)MiRNA-300轉(zhuǎn)染的結(jié)直腸癌細(xì)胞植入裸鼠，研究MiRNA-300對(duì)在體腫瘤生長(zhǎng)的影響；4，MiRNA-300導(dǎo)致腫瘤異常增殖和侵襲的分子機(jī)制。
　　方法：
　　1、結(jié)直腸癌中的異常表達(dá) miRNAs篩選及驗(yàn)證，采用組織芯片初步篩選技術(shù)在結(jié)直

13、腸癌組織中探測(cè)表達(dá)明顯改變的MiRNA。利用熒光定量驗(yàn)證在結(jié)直腸癌組織和結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的MiRNA表達(dá)水平。并通過(guò)Western blot及數(shù)理統(tǒng)計(jì)研究MiRNA-300在不同結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)分布。
　　2、通過(guò)病毒轉(zhuǎn)染，研究MiRNA-300對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞系增殖和侵襲能力的影響。分別是通過(guò)細(xì)胞成團(tuán)實(shí)驗(yàn)來(lái)研究結(jié)直腸癌細(xì)胞系增值能力的變化，以及利用細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)來(lái)研究MiRNA-300含量的提高對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響。
　

14、　3、通過(guò)將MiRNA-300轉(zhuǎn)染的結(jié)直腸癌細(xì)胞系和未經(jīng)過(guò)MiRNA-300轉(zhuǎn)染的結(jié)直腸癌細(xì)胞系分別注入裸鼠皮下，研究MiRNA-300對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞系在裸鼠體內(nèi)成瘤能力的影響。
　　4、通過(guò)基因篩選選擇MiRNA-300潛在靶基因，并通過(guò)Western Blot以及熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證MiRNA-300與p53之間的聯(lián)系。
　　結(jié)果：
　　1、通過(guò)對(duì)結(jié)直腸癌組織芯片和結(jié)直腸癌細(xì)胞系中MiRNA-300表達(dá)水平的測(cè)量，發(fā)現(xiàn)

15、在原發(fā)性結(jié)直腸癌、淋巴轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌中MiRNA-300的表達(dá)水平明顯高于正常組織細(xì)胞。相較于正常癌旁組織，原發(fā)性結(jié)直腸癌組織細(xì)胞中MiRNA-300含量高約27%：而在淋巴轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌細(xì)胞中，相較于正常癌旁組織，MiRNA-300含量提高約18%及19%。在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中，Sw620比正常黏膜組織細(xì)胞系中MiRNA-300含量高約41%，Caco2及 HT29細(xì)胞系相較正常黏膜組織細(xì)胞系MiRNA-300提高約2

16、0%及24%。該統(tǒng)計(jì)結(jié)果具有顯著性差異，p<0.05。
　　2、經(jīng)過(guò)MiRNA-300轉(zhuǎn)染的結(jié)直腸癌細(xì)胞與未經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染的結(jié)直腸癌細(xì)胞相比，細(xì)胞侵襲力和細(xì)胞活性明顯增強(qiáng)。在細(xì)胞活性的檢測(cè)中，經(jīng)過(guò)MiRNA-300轉(zhuǎn)染后的結(jié)直腸癌細(xì)胞系比未經(jīng)過(guò)MiRNA-300轉(zhuǎn)染的結(jié)直腸癌細(xì)胞系細(xì)胞活性高23%；在細(xì)胞成團(tuán)實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染的結(jié)直腸癌系聚集成團(tuán)現(xiàn)象明顯多于未經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染的結(jié)直腸癌細(xì)胞系，經(jīng)過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)，成團(tuán)細(xì)胞高約70%；在48小時(shí)細(xì)胞侵襲實(shí)

17、驗(yàn)中，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染的結(jié)直腸癌細(xì)胞系侵襲距離大概為未經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染的結(jié)直腸癌細(xì)胞系侵襲距離的2倍。
　　3、在裸鼠體內(nèi)經(jīng)過(guò)MiRNA-300轉(zhuǎn)染的結(jié)直腸癌細(xì)胞比未經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染的結(jié)直腸癌細(xì)胞成瘤能力明顯增強(qiáng)。分別測(cè)量二者的體積和重量后得知，經(jīng)過(guò)MiRNA-300轉(zhuǎn)染的結(jié)直腸癌細(xì)胞系的平均成瘤體積為1130mm3，平均重量為0.8g；而在未經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染的結(jié)直腸癌細(xì)胞系中，平均成瘤體積為840mm3，平均重量為0.46g；體積增長(zhǎng)約為35%，而重量增長(zhǎng)約為

18、74%。該統(tǒng)計(jì)具有顯著性差異，p<0.05。
　　4、通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MiRNA-300與p53有著明顯的協(xié)同作用，MiRNA-300的上調(diào)及下調(diào)分別導(dǎo)致了p53含量的升高及降低；之后又發(fā)現(xiàn)MiRNA-300與p53的3’-UTR有著明顯的熒光共定位現(xiàn)象，由此我們可以推斷p53正是3’-UTR的下游調(diào)控靶基因。
　　結(jié)論：
　　1、在原發(fā)性結(jié)直腸癌細(xì)胞中MiRNA-300含量相較于整腸黏膜組織細(xì)胞有所提高，而在淋巴轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)

19、處轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織中MiRNA-300的含量也有所提升。而在分別代表三種不同類(lèi)型的細(xì)胞系中我們驗(yàn)證了相同的結(jié)果。
　　2、經(jīng)MiRNA-300轉(zhuǎn)染后的結(jié)直腸癌細(xì)胞系細(xì)胞活性增強(qiáng)及細(xì)胞聚集成團(tuán)能力顯著提升；經(jīng)過(guò)MiRNA-300轉(zhuǎn)染后的結(jié)直腸癌細(xì)胞系與正常結(jié)直腸癌細(xì)胞系相比，細(xì)胞侵襲距離顯著提高。
　　3、經(jīng)過(guò)MiRNA-300轉(zhuǎn)染后的結(jié)直腸癌細(xì)胞系與未經(jīng)過(guò)MiRNA-300轉(zhuǎn)染的結(jié)直腸癌細(xì)胞系相比，成瘤體積及成瘤重量都有著

20、顯著的提升，這代表MiRNA-300對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞系的成瘤能力有著明顯的促進(jìn)作用，也就進(jìn)一步證實(shí)了MiRNA-300對(duì)結(jié)直腸癌增值能力有著明顯的促進(jìn)作用。
　　4、MiRNA-300的上調(diào)及下調(diào)分別導(dǎo)致了p53含量的升高及降低，表明了MiRNA-300與p53有著明顯的聯(lián)系，而p53含量的提升與降低也影響著MiRNA-300的表達(dá)，二者之間的關(guān)系極其密切，MiRNA-300與p53的3’-UTR緊密相接，這就證實(shí)了二者在結(jié)直腸癌細(xì)