γ-氨基丁酸(GABA)對(duì)結(jié)直腸癌的影響及其分子機(jī)制探討.pdf

1、研究背景和目的：
　　γ-氨基丁酸（GABA）是一種天然活性成分，廣泛分布于動(dòng)植物體內(nèi)，如：米胚芽、米糠、茶和乳酸菌、酵母等。GABA具有很多重要的生理功能，如鎮(zhèn)靜神經(jīng)、抗焦慮、調(diào)節(jié)激素分泌、降血壓、抗衰老等。近年來有研究表明，GABA對(duì)肝癌、肺癌、胰腺癌和膽管癌等具有較好的抗腫瘤活性，但其對(duì)結(jié)直腸癌的應(yīng)用效果及其分子機(jī)制研究較少，鑒于此，本課題首先利用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，探討GABA對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、遷移和侵襲的影響及其分子機(jī)

2、制，其次利用細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，探討GABA對(duì)結(jié)直腸癌化療敏感性的影響，為GABA在結(jié)直腸癌的預(yù)防和輔助治療中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　研究方法：
　　本研究選用三株結(jié)直腸癌細(xì)胞（SW620、SW480、HCT116），利用CCK-8、流式細(xì)胞技術(shù)及Transwell遷移和侵襲等方法觀察GABA對(duì)三種結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期及遷移和侵襲的影響；在此基礎(chǔ)上，利用RNA-Seq篩選GABA處理三種細(xì)胞后的差異表達(dá)基因，并采用qR

3、T-PCR對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證；采用qRT-PCR檢測(cè)GABA對(duì)其 A、B型受體在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的mRNA水平表達(dá)的影響；利用CCK-8方法在體外觀察GABA與5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑化療藥聯(lián)用對(duì)細(xì)胞增殖的影響；利用SW480細(xì)胞株，構(gòu)建裸鼠皮下結(jié)直腸癌荷瘤小鼠模型，將GABA與奧沙利鉑聯(lián)合應(yīng)用于荷瘤小鼠，通過觀察腫瘤生成情況，免疫組化檢測(cè)移植瘤組織中Ki67蛋白的表達(dá)，Tunel染色法觀察裸鼠移植瘤細(xì)胞的凋亡情況，探討GABA與化療藥聯(lián)用

4、對(duì)腫瘤的抑制作用。
　　研究結(jié)果：
　　細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，首先在細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期方面，100??GABA即可顯著抑制SW620、SW480、HCT116三種結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖（P<0.05），抑制率分別為32.53?7.34%、33.88?2.60%、41.35?10.48%，繼續(xù)增加GABA濃度至400??，抑制作用未見增強(qiáng)；GABA可使SW620、SW480細(xì)胞的S期數(shù)量分別減少15%、13%，使HCT116細(xì)胞的G1/G0

5、期數(shù)量減少10%，G2/M期數(shù)量增加30%；GABA可有效抑制SW620、SW480細(xì)胞的遷移和侵襲。其次，RNA-Seq篩選及qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示，GABA可顯著下調(diào)三種細(xì)胞中FOS、FOSB、NR4A1、EGR1、EGR2基因的表達(dá)（P?0.05），顯著下調(diào)FRMD4A基因在HCT116細(xì)胞中的表達(dá)（P?0.0001），上調(diào)FRMD4A基因在SW620、SW480細(xì)胞中的表達(dá)（P?0.0001）；qRT-PCR結(jié)果顯示GABA

6、可顯著影響其 A、B型受體在三種細(xì)胞中的mRNA表達(dá)水平（P<0.05）（即SW620：GABAA?2、GABAAδ上調(diào)，GABAAγ2下調(diào)；SW480：GABAAδ上調(diào)，GABAAε、GABAB1下調(diào)；HCT116：GABAA?2、GABAA?3、GABAAβ3、GABAB2、GABAAβ2、GABAAγ2下調(diào)）。最后，GABA與5-氟尿嘧啶聯(lián)用后，對(duì)SW620、SW480及HCT116細(xì)胞增殖的抑制率分別增加6.28?4.13%、2

7、.03?1.71%、2.68?2.19%；與奧沙利鉑聯(lián)用后，對(duì)SW620、SW480及HCT116細(xì)胞增殖的抑制率分別增加2.75?2.69%、4.10?2.48%、7.28?1.54%。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，與奧沙利鉑組相比，GABA與奧沙利鉑聯(lián)用后，可顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)，減少移植瘤組織中Ki67蛋白的表達(dá)并促進(jìn)移植瘤細(xì)胞的凋亡。
　　結(jié)論：
　　GABA可能通過下調(diào)FOS、FOSB、NR4A1、EGR1、EGR2基因，上